[发明专利]一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法

说明书

本发明公开了一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法，包括，步骤一：嗜酸性PGPR菌株筛选；将营养琼脂培养基平板pH调为5.5进行嗜酸细菌的筛选；根际土样悬浮液不做80℃热处理；步骤二：不同酸碱度条件下菌株抑菌活性测定；(1)供试菌株发酵液制备如下：将活化的菌株接种于1.1中不同pH的NB中，本发明涉及烟草技术领域，该嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法通过以菌治菌的角度出发，分别在酸性和中性条件下的研究其对青枯菌的抑菌活性、防病促生作用及相关生防特性，并结合BIOLOG–GEN‑Ⅲ鉴定和16SrDNA基因序列同源性分析对菌株进行分类与鉴定，为提高酸性土壤中烟草青枯病生防效果提供高效微生物资源及其应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及烟草技术领域，具体为一种一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法。

背景技术

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌引起的一种毁灭性土传病害，每年对烟草生产造成巨大的经济损失，影响烟草青枯病发生的因素很多，其中土壤环境条件是最重要的影响因子，包括如土壤类型、酸碱度、微量元素含量等，近年来，由于大面积连作、环境污染、酸性肥料施用等因素导致我国植烟土壤酸化日趋严重。

土壤酸化与青枯病的发生密切相关，青枯病发生土壤pH值明显低于正常土壤pH，酸化植烟土壤中青枯病发生日趋严重，严重制约烟草产量和质量，目前我国烟区都面临着由于连作导致的植烟土壤酸化问题，而土壤酸化导致烟草青枯病等土传病害发生重，已影响到当地烟叶的可持续发展。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种一种嗜酸性PGPR菌株的筛选、鉴定及其生防活性方法，解决了酸化植烟土壤中青枯病严重制约烟草产量和质量的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种嗜酸性PGPR 菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：嗜酸性PGPR菌株筛选

(1)将营养琼脂培养基平板pH调为5.5进行嗜酸细菌的筛选；

(2)根际土样悬浮液不做80℃热处理。

步骤二：不同酸碱度条件下菌株抑菌活性测定

(1)供试菌株发酵液制备如下：将活化的菌株接种于1.1中不同pH的NB中，28℃、150r/min振荡培养24h后在紫外分光光度计下调整浓度为 108CFU/mL、不同pH条件的标准菌液。

(2)不同酸碱度条件下菌株发酵液抑菌活性测定

琼脂扩散法测定菌株发酵液抑菌活性：取对数期108CFU/mL青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μL菌株发酵液，阴性对照为等量相同pH的 NB培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。

(3)酸性条件下菌株无菌滤液对青枯菌抑制作用

无菌滤液制备：菌株标准菌液按体积比1％分别接种于pH5.5的NB中，28℃、 150r/min振荡培养48h后的发酵液低温条件下5000r/min离心5min后，上清液经细菌过滤器除菌获得无菌滤液。

(4)琼脂扩散法测定菌株无菌滤液抑菌活性：取对数期108CFU/mL青枯菌菌液均匀喷雾平板，琼脂孔中加入50μL菌株无菌滤液，阴性对照为等量相同pH的NB培养基，28℃培养48h后观察，十字交叉法测量抑菌带宽度。

(5)菌株无菌滤液对菌体的影响采用透射电镜观察法：分别取10mL菌株无菌滤液与1mL青枯菌发酵液混合培养，空白对照是10mLNB培养基，每个处理3个重复。

进一步，经酸性平板初筛试验的抑菌圈大小获得抑菌活性较好的10株拮抗细菌；拮抗活性最好菌株17。