[发明专利]PNA在检测DNA裂解片段中的应用

说明书

本发明公开了一种PNA在检测DNA裂解片段中的应用，以及相应的检测DNA裂解片段的方法和引物组。本发明通过基于修饰的PNA钳制PCR，来选择性扩增裂解后的DNA，而未被裂解的模板DNA则被PNA抑制，根据PCR结果即可定性或定量的分析酶促反应，可应用于监测酶活性、检测循环肿瘤DNA和循环胎儿DNA等。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，更具体的涉及PNA在检测DNA裂解片段中的应用，以及相应的检测方法。

背景技术

酶(天然和人工酶)是生物化学和生物技术中最有价值的工具之一。目前，在3600种已知的限制性内切酶中，有300多种酶具有250多种不同的特异性，它们被用于实验室、医院和工业中，以裂解各种DNA底物用于不同目的。而且寻找新的酶仍然是问题之一。限制酶的普遍用途之一是双链DNA的位点选择性切割，以得到有用的片段。然而，分析酶促反应的效率并不容易，特别是当存在大量背景DNA，DNA底物的浓度非常低时，裂解后的DNA被背景DNA所干扰，非常难检测。

肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA有3个特点：1、PNA与DNA的结合能力胜于DNA与DNA的结合能力；2、DNA/PNA双链比DNA/DNA双链的稳定性高；3、PNA易于识别单碱基错配的DNA或RNA结合。由于匹配的PNA对靶位点具有更高的亲和力，因此相对引物的结合更具优势。由于Taq聚合酶无法扩展PNA，因此这种结合的作用使扩增反应受到损害，这就是PCR钳制。当存在突变序列时，PCR引物的结合将超过PNA结合，从而产生扩增子。因此，PNA-PCR主要用于点突变的基因检测，它能与未突变的基因结合，阻止引物与未突变的基因结合，与突变的基因则不能结合，而引物可与突变的基因结合，从而使突变基因扩增。PCR钳制也可以通过干扰引物的延伸来进行，其中PNA位于距PCR引物一定距离或与PCR引物之一相邻的位置。但是，这种PCR钳制不能用于检测裂解后的DNA。

发明内容

1、发明目的。

本发明的目的是提供PNA在检测DNA裂解片段中的应用，基于该应用，可将裂解后的DNA扩增，而未裂解的模板DNA则被抑制，从而能检测出裂解后的DNA。

2、本发明所采用的技术方案。

本发明公开了PNA在检测DNA裂解片段中的应用。

本发明公开了一种定性检测DNA裂解片段的方法，其步骤包括：

(1)设计引物组和PNA探针组序列，所述引物组和PNA探针组的核苷酸序列部分重叠，重叠部分包括待检测的DNA裂解片段的端部核酸序列；

(2)以待测样品为模板，加入引物组和PNA探针组进行PCR反应，然后电泳查看结果，能观察到核酸条带说明存在待检测的DNA裂解片段。

优选的，所述引物组的引物为单碱基错配引物，错配位点位于PNA探针和核酸扩增引物重叠序列的中间。

本发明还公开了一种实时检测DNA裂解片段的方法，其步骤包括：

(1)设计引物组、PNA探针组和TaqMan MGB探针序列，所述引物组和PNA探针组的核苷酸序列部分重叠，重叠部分包括待检测的DNA裂解片段的端部核酸序列；

(2)以待测样品为模板，加入引物组、PNA探针组、TaqMan MGB探针进行荧光定量PCR，标准曲线法进行定量分析，查看扩增结果。

优选的，所述引物组的引物为单碱基错配引物，错配位点位于PNA探针和核酸扩增引物重叠序列的中间。

本发明公开了一组用于定性检测SRY基因裂解片段的引物和PNA探针组合，包括：