[发明专利]一种制备屈昔多巴的方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种制备屈昔多巴的方法和应用，所述制备屈昔多巴的方法是利用醛缩酶进行不对称缩合，以3,4‑二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，通过醛缩酶催化，仅需一步反应即可合成所需要的产物，所用的醛缩酶催化活性及手性选择性高，无需手性化学拆分，理论上原子利用率为100%，反应过程简单，绿色环保，原子经济性极高，克服了化学法合成屈昔多巴的缺陷，是一种极具竞争力的屈昔多巴制备方法，解决了现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种制备屈昔多巴的方法和应用。

背景技术

屈昔多巴(Droxidopa)，也叫屈西多巴，化学名称是(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)-3-羟基丙酸，它是一种白至灰白色结晶或结晶粉的化学品，通常为抗帕金森症药，临床上主要用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕。

目前，屈昔多巴的制备方法通常是通过化学拆分法进行制备，例如，以3,4-二羟基苯甲醛为起始原料，经苄基保护制得3,4-二苄氧基苯甲醛，并与甘氨酸缩合生成外消的苏赤式-3-(3,4-二苄氧基苯基)丝氨酸，经手性拆分及催化加氢制得屈昔多巴，该方法理论收率只能达到50％，原子经济性差，而且所用试剂多，步骤繁琐，环境污染大，是一种非常不经济环保的方式。为了提高环保性，部分人是通过苄氯保护羟基得到的3,4-二苄氧基苯甲醛为底物，以醛缩酶为催化剂进行不对称缩合，并通过后续的手性拆分及钯碳加氢等操作获得屈昔多巴，该方法相较于传统的化学合成法有较大优势，但仍然存在酶手性选择性不佳的问题，并且该方法仍然存在较多步骤的化学反应，在经济性、环保等方面仍有提高的空间。因此，上述的技术方案在实际操作时存在以下不足：现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种制备屈昔多巴的方法，以解决上述背景技术中提出的现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：

以3,4-二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，以PLP(Pyridoxal5-phosphatemonohydrate，磷酸吡哆醛)为辅酶，以醛缩酶为催化剂，并共同置于缓冲液中构成反应体系进行酶催化反应，分离，得到所述的屈昔多巴。

作为本发明进一步的方案：所述醛缩酶是由醛缩酶基因编码的酶，其中，所述醛缩酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述醛缩酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，所述醛缩酶基因的核苷酸序列与氨基酸序列也可以参考使用中国专利(专利公开号CN110869383A)工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用中的工程化多肽。

作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，各原料在所述反应体系中的浓度分别为：醛缩酶0.5-200g/L，磷酸吡哆醛0.01-0.5mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10-200g/L，甘氨酸5-40mol/L。

作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，各原料在所述反应体系中的浓度分别为：醛缩酶1-20g/L，磷酸吡哆醛0.2-0.4mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10-40g/L，甘氨酸5-20mol/L。

作为本发明再进一步的方案：优选的，所述的醛缩酶为购自宁波酶赛生物工程有限公司的产品，其是通过在大肠杆菌重组表达出来的蛋白，为大肠杆菌表达产物，表达基因是醛缩酶基因，宿主细胞为E.Coli,BL21(DE3)。对应的，所述醛缩酶可以是表达所述醛缩酶的大肠杆菌噬菌体、细胞破碎上清或酶粉，即为大肠杆菌表达产物所对应的大肠杆菌湿菌体、细胞破碎上清或酶粉，具体根据需要进行选择，这里并不作限定。