[发明专利]利用CRISPR/Cas9和PiggyBac实现双等位精确基因组编辑的系统在审

专利信息
申请号: 202010888329.1 申请日: 2020-08-28
公开(公告)号: CN111961686A 公开(公告)日: 2020-11-20
发明(设计)人: 张智英;李倩;徐坤;李欣憶;邢佳妮;李鹏程;麻丽霞;吕明 申请(专利权)人: 西北农林科技大学
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/65
代理公司: 西安通大专利代理有限责任公司 61200 代理人: 范巍
地址: 712100 陕*** 国省代码: 陕西;61
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摘要:
搜索关键词: 利用 crispr cas9 piggybac 实现 等位 精确 基因组 编辑 系统
【说明书】:

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac实现双等位精确基因组编辑的系统。构建CRISPR/Cas9表达载体、PiggyBac系统介导的供体载体以及PiggyBac转座酶表达载体,通过CRISPR/Cas9表达载体打靶基因组,造成DNA双链断裂,使用PiggyBac系统介导的供体载体进行HDR修复,再利用PiggyBac转座酶表达载体进行筛选标记的删除,从而实现高效、精确的双等位无筛选标记的基因组编辑,可应用于畜禽转基因育种。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,涉及CRISPR/Cas9与PiggyBac技术相结合的双等位精确、高效基因组编辑。

背景技术

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑,使用RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9),在特定的基因组位点剪切DNA造成双链断裂(double strand breaks,DSBs),通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径或者使用依赖同源DNA修复模板的同源重组(homology-directed repair,HDR)途径修复Cas9介导的DSBs。非同源末端连接修复可通过产生插入和缺失来破坏靶基因,而同源重组修复可以将遗传变化更精确的整合到基因组中。近年来,基因组精确编辑在畜禽性状改良、基因功能研究以及畜禽动物模型的建立等方面得到了广泛应用。

目标位点纯合且无筛选标记的基因编辑细胞系能保证细胞系遗传背景一致、基因拷贝数一致,有利于基因功能的研究。HDR-Cre/LoxP和HDR-HDR是目前主要的两步法无筛选标记基因编辑技术。其中,HDR-Cre/LoxP系统利用Cre/LoxP技术实现筛选标记的有效切除,进而达到基因组编辑的目的(Xi et al.,2015)。但是,该技术会在基因组残留一个外源LoxP位点,不能满足基因编辑操作过程中点编辑或者点突变的要求。HDR-HDR策略(Kuhnand Chu,2015)则是通过CRISPR/Cas9系统两次介导供体DNA的HDR,在打靶基因组时,通过无标记基因(含有目的点突变)供体DNA的HDR实现基因组的精确编辑,但HDR-HDR策略仍受限于基因组HDR的重组效率。为此,有研究提出了单链退火(SSA)介导的动物基因组精确编辑系统(2019),尽管可以获得较高的基因组双等位编辑效率,并可通过单链退火(SSA)修复机制介导筛选标记的删除,但在依赖SSA修复途径敲出筛选表达盒时,不同的基因组位点在敲出效率上有较大差异。

PiggyBac转座子可将长度达100kb的DNA序列插入位于哺乳动物基因组的“TTAA”序列中。由于转座效率高,PiggyBac在稳定表达多亚基蛋白质复合物、转基因小鼠及诱导多能干细胞、大规模生产重组体中广泛应用。目前,已有将PiggyBac与CRISPR/Cas9结合应用的报道。例如,中国专利CN109652458A提出了一种基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法。但PiggyBac转座子在高效删除的同时,可能会随机插入于基因组的其他TTAA位点,获得的细胞仍有存在筛选标记的残留的可能,且获得纯合基因组编辑细胞的效率较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9和PiggyBac实现双等位精确基因组编辑的系统,可采用PiggyBac转座方式删除筛选标记基因,实现双等位、无残留、无痕迹的基因组精确编辑,提高编辑效率。

为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:

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