[发明专利]辅助诊断结直肠癌的组合物、试剂盒及其用途

说明书

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及Septin9、NDRG4和SDC2三个基因的甲基化检测。本发明提供了一种辅助诊断结直肠癌的组合物；同时，还提供了含该组合物的试剂盒，所述组合物的用途。使用本发明的组合物能够以高灵敏度和特异性对早期结直肠癌进行筛查，三基因联合检测，减少了上样量，也减少了操作，避免样本被过度稀释，其成本低，操作便捷。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及辅助诊断结直肠癌的领域，更具体地，涉及Septin9、NDRG4和SDC2三个基因的甲基化检测。

背景技术

结直肠癌作为现行比较高发的消化道肿瘤，由于其起病的隐匿性，使得大多数人在确诊时已经是中晚期，因此，结直肠癌的早期筛查对于治疗结直肠癌是非常重要的。

目前在结直肠癌筛查上主要有两种常用技术。一种是大便隐血试验。该方法是检测大便中的血液成分（检测对象是血红蛋白），若多次、持续的阳性反应提示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。该法的优点是结果显示快、清晰，结果可以半定量。但其特异性差，抗干扰能力差缺点也很明显，其次该方法的灵敏度差一级限制条件非常多等因素也影响了其作为结直肠癌诊断的准确判断。另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的诊断方法，也是目前其它诊疗手段无法替代的主要手段。然而，其也存在一系列的缺点：包括检查前期准备工作的不友好性以及检查过程中病人的痛苦两方面，大大影响了该项技术的实际应用和推广。

除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。目前，已有大量的结直肠癌分子标记物在组织和血液样本中被研究和报道，例如：

Septin9基因是Hartwell等发现的Septin基因家族成员之一，具有鸟苷三磷酸酶（GTPase）活性。Septin9基因位于人类染色体17q25.3，含有17个外显子，长约2.40×10⁵bp，编码Septin 9蛋白。但由于其转录产物包含多个翻译起点和变异剪接，Septin9可变异产生18种变异剪接体、编码15种多肽。Septin9基因及其表达产物广泛参与人体各种生理过程，如细胞极化、细胞增殖与凋亡、细 胞内外物质运输、细胞骨架调节等。研究表明，Septin9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，其甲基化会抑制其基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。

NDRG4（N-myc downstream-regulated gene 4）为抑癌基因NDRG基因家族成员，基因长32kb，由17个外显子和16个内含子组成。大量研究表明，NDRG4基因与肿瘤的发生、发展和转移有关，其5’端调控区含有CpG岛，在结直肠癌的发展过程中常常被甲基化，被认为是结直肠癌的重要生物学特征。因此，通过NDRG4基因启动子区域甲基化水平的检测为结直肠癌的无创筛查提供了有效途径。

SDC2基因是已知的一种参与细胞分裂、迁移和在结肠间充质细胞中表达的蛋白质。据发现，肿瘤组织中SDC2目标区域的甲基化水平，显著地更高于成对相邻非肿瘤组织中的SDC2目标区域。通过分析133例CRC患者原发肿瘤和其成对相邻非肿瘤组织样本中的SDC2甲基化水平，研究人员发现，SDC2基因的转录调控区域中，肿瘤组织样本显示甲基化水平显著地更高于对照的相邻非肿瘤组织样本。

目前，根据样本的预处理方式不同，现有的DNA甲基化检测技术主要有三大类：

1）基于限制性酶切预处理的甲基化检测技术：这种方法是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区域不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，再通过PCR扩增分离产物，以明确目标片段的甲基化状态；

2）基于亚硫酸盐修饰预处理的甲基化检测技术：这种方法是DNA经亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶（C）被转化成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不变。处理后的DNA通过测序或使用特异性引物PCR得到非常准确的DNA序列甲基化位点信息；