[发明专利]一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，将人源PCSK9-201转录本的CDS及polyA元件全片段替换在小鼠PCSK9-201基因的对应片段，所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段为SEQ ID NO：1；并且所述人源PCSK9-201转录本的CDS的基因片段在小鼠PCSK9-201转录本ENSMUST00000049507.5的翻译起始位点开始全片段替换；人源PCSK9在内源小鼠PCSK9基因的调控下表达；所述polyA元件的插入长度约为2.9kb；具体包括如下步骤：

(1)打靶载体的设计、构建和纯化：包括设计sgRNA，采用巢式PCR、测序检测sgRNA的活性，构建sgRNA表达载体，构建携带靶位点同源臂及插入序列的Donor vector，将Donorvector转化到DH5a感受态细胞中，扩大培养后提取质粒并纯化，获得donor片段产物；

(2)体外转录：体外转录合成Cas9 mRNA以及sgRNA；

(3)Cas9/sgRNA的显微注射：将步骤(2)体外转录合成的Cas9 mRNA、sgRNA和步骤(1)获得的donor片段混合并调整浓度，显微注射到小鼠受精卵中，再将受精卵移植到假孕的母鼠输卵管中，等待F0代小鼠出生；

(4)F0代小鼠的鉴定及可遗传性检测；

步骤(1)中，sgRNA序列为SEQ ID NO：2；且PAM序列为：GGG；在采用巢式PCR、测序检测sgRNA的活性中，采用的out引物对为GPT000208-HPCSK9-S-OutF1：SEQ ID NO：3，GPT000208-HPCSK9-S-OutR1：SEQ ID NO：4；int引物对为GPT000208-HPCSK9-S-intF1：SEQID NO：5，GPT000208-HPCSK9-S-intR1：SEQ ID NO：6；

测序方式为对int引物扩增产物测序，测序引物序列为：GPT000208-HPCSK9-S-intR1：SEQ ID NO：9。

2.根据权利要求1所述的一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：Cas9表达质粒，经酶切线性化，抽提纯化后作为模板进行体外转录合成Cas9 mRNA；将步骤(1)获得的sgRNA表达载体经酶切线性化，抽提纯化后作为模板进行体外转录合成sgRNA。

3.根据权利要求1或2任一项所述的一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)包括如下步骤：通过两端PCR鉴定筛选出中靶小鼠模型F0代，对两端PCR鉴定阳性的F0代小鼠进行测序验证，测序正确的小鼠模型为阳性；阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配繁殖获得F1代小鼠，根据F0代小鼠的PCR鉴定方法与测序方法对F1代小鼠鉴定筛选，获得可稳定遗传的阳性F1代小鼠。

4.根据权利要求3所述的一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，两端PCR鉴定中采用的引物如下：

5’同源臂：GPT000208-hPCSK9-5tF1：SEQ ID NO：10，GPT000208-hPCSK9-5tR1：SEQ IDNO：11；

3’同源臂：GPT000208-hPCSK9-3tF1：SEQ ID NO：12，GPT000208-hPCSK9-3tR1，SEQ IDNO：13。

5.权利要求3或4所述的一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠品种为C57BL/6J。