[发明专利]一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用在审

专利信息
申请号: 202010892763.7 申请日: 2020-08-28
公开(公告)号: CN111979266A 公开(公告)日: 2020-11-24
发明(设计)人: 琚存祥;赵静;陈中;杨笑柳 申请(专利权)人: 江苏集萃药康生物科技有限公司
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/57;A01K67/027
代理公司: 北京天盾知识产权代理有限公司 11421 代理人: 孙倩倩
地址: 210032 江苏省南京*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 pcsk9 人源化 小鼠 模型 构建 方法 及其 应用
【说明书】:

发明涉及一种PCSK9人源化小鼠模型的构建方法及其应用。本发明选择与小鼠对应的PCSK9‑201转录本的CDS(NM_174936.4)在小鼠上进行人源基因的替换。通过打靶载体的设计、构建和纯化,体外转录,Cas9/sgRNA的显微注射,F0小鼠的鉴定及可遗传性检测等步骤,获得阳性F1代小鼠。并对hPCSK9小鼠中人源PCSK9的表达以及血脂水平进行验证,表明按本申请方法构建的hPCSK9小鼠,能够成功良好地表达人源PCSK9蛋白,并且在本底状态下血液中LDL‑C水平正常,可以作为一种人源化动物模型进行高血脂症疾病模型的诱导,应用于靶向PCSK9人源抗体或药物的筛选和药效评价。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域,具体地说,涉及基于基因编辑技术的PCSK9基因修饰人源化动物模型的构建方法。

背景技术

据世界卫生组织统计,全球每年有1790万人死于心血管疾病,心血管疾病仍然人类疾病致死的首要因素,高于肿瘤和其他疾病。中国的心血管疾病的患病率也处于持续上升的阶段,据《中国心血管病报告2017》显示,我国的心血管病患者约2.9亿,2015年每5例死亡中就有2例死于心血管疾病。血脂异常是引起动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素之一。2002年CHNS、2010年中国慢性肾病工作组调查和《中国居民营养与慢性病状况调查(2015年)》显示,我国成人血脂异常的患病率分别为18.6%、34.0%和40.4%,10年间中国成人血脂异常患病率大幅上升,这与我国心血管疾病的发病增加关系密切。因此,降血脂药物的开发对于降低我国心血管疾病的发生和致死率都具有极其重要的意义。

血脂的重要组分胆固醇参与细胞膜的形成并调节其流动性,此外还是合成胆汁酸,维生素D以及甾体激素的重要前体。然而血液中胆固醇水平的异常升高,尤其是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的升高已被大量的研究证实与动脉粥样硬化的发生发展存在密切的关系。目前被广泛应用于降低血脂的他汀类药物(Statin)是甲羟戊酸途径上游HMG-CoA还原酶的特异性抑制剂,对甲羟戊酸途径的抑制会使细胞中胆固醇合成的重要前体法尼基焦磷酸(FPP)减少,从而导致胆固醇合成量降低,最终起到降低血液中胆固醇的效果。但是他汀类药物的使用也存在局限性,一方面这种药物会引起骨骼肌功能紊乱从而带来毒副作用,使得30%左右的病人无法长期耐受这种药物,另一方面部分病人即便在高剂量他汀药物的暴露下仍无法获得明显的降脂效果,因此对于高血脂症,我们也迫切需要他汀降脂的替代疗法。食物和自身合成来源的胆固醇在血液中的运输依赖于脂蛋白。机体内的细胞通过其膜表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)与胞外的LDL结合并介导内化作用形成包含有LDL的胞内体,最终与溶酶体融合降解LDL,从而达到利用胆固醇并控制血液中LDL-C水平的目的。值得注意的是,LDLR与LDL在中性条件下结合并发生内化进入细胞,而在细胞中胞内体酸性的环境又使得LDLR与LDL脱离并被重新招募到细胞膜表面继续发挥作用,但这种对LDLR的重复利用也受到了精细的调控。Proprotein convertase subtilisin/kexin type9(PCSK9)是已知的一种对LDLR在细胞膜的表达水平起负调控作用的细胞分泌因子,主要在肝脏组织中高表达,此外在肾脏和小肠中也有小量的表达。PCSK9被分泌到胞外后会与细胞表面的LDLR结合形成PCSK9/LDL-R复合物,此复合物中的LDLR在发生内化作用进入胞内体后无法再与LDL分离并重新被招募到细胞膜表面,而是与PCSK9和LDL一起进入溶酶体被降解。因此PCSK9可通过促进LDLR的降解起到减少细胞利用胞外LDL-C的作用。对人类PCSK9基因的研究表明,PCSK9功能获得性突变与家族性高血脂症相关,而携带PCSK9功能缺失性突变的人群其LDL-C水平较常人低15~28%,相应的心血管疾病的发病率也较正常人群减少50%以上。同样在小鼠体内过表达和敲除PCSK9分别会下调和上调LDLR的表达水平,改变小鼠对血液中LDL-C的清除能力,造成这两种小鼠出现高血脂症和低血脂症的表型。因此PCSK9是体内胆固醇代谢途径中一种重要的调节因子,抑制其表达水平或活性能显著降低血液中的“坏”胆固醇LDL-C的水平,是进行降脂药物开发的高效靶点。

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