[发明专利]一种快速鉴定二倍体T0

权利要求书

1.一种快速鉴定二倍体T₀代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以二倍体T₀代基因编辑作物的DNA为模板，在靶标编辑位点下游设计特异性引物，进行PCR扩增，得PCR产物；

(2)对所述PCR产物进行变性和复性后，与T7E1酶混合后，在37℃孵育30min，终止反应，电泳后只有一个条带的为野生型或双等位基因纯合突变植株PCR产物；

(3)将待检测野生型或双等位基因纯合突变植株植株的PCR产物与已知野生型植株的PCR产物等量混合后变性和复性，与T7E1酶混合后，在37℃孵育30min，终止反应，电泳后只有一个条带表示待检测植株为野生型，电泳后有三个条带表示待检测植物为双等位基因纯合突变植株。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)在靶标编辑位点下游500～800bp处设计特异性引物。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系以20μl计算，包括：模板1μl，10mM dNTPs 0.5μl，上下游引物各0.5μl，10×Ex TaqBuffer2μl，Ex Taq0.1μl，余量为水。

4.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性1min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述变性和复性的反应体系包括：10×NEBuffer22μl，待检测植株的PCR产物4μl和Nuclease-free Water 13.5μl。

6.根据权利要求1或5所述方法，其特征在于，步骤(2)所述变性和复性的反应程序包括：95℃5min；90℃30s，85℃1s，每个循环降0.1℃，600个循环；4℃保存。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，经过所述变性和复性的PCR产物与T7E1酶的体积比为19.5:0.5。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述变性和复性的反应体系包括：10×NEBuffer 22μl，野生型或双等位基因纯合突变植株PCR产物2μl，待检测植株PCR产物2μl和Nuclease-free Water 13.5μl。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述终止反应，均包括向所述孵育后的孵育液中加入0.25M的EDTA水溶液。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述孵育液与EDTA水溶液的体积比为20:1.5。