[发明专利]一种快速鉴定二倍体T0

说明书

本发明提供了一种快速鉴定二倍体T₀代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法，涉及基因型鉴定技术领域；通过T7E1内切酶处理待测T₀代基因编辑植株的PCR产物来去除嵌合体、杂合体和双等位基因杂合突变植株，得到双等位基因纯合突变或野生型植株，然后将待测的双等位基因纯合突变或野生型植株的PCR产物和已知野生植株的PCR产物进行等量混合后用T7E1内切酶处理，从而快速鉴定出双等位基因纯合突变植株。对得到的双等位基因纯合突变植株的PCR产物进行sanger测序，证实本发明所述方法可行。

技术领域

本发明属于植株基因型鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定二倍体 T₀代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法。

背景技术

以核酸酶为基础的基因组编辑技术在作物育种中得到迅猛发展，这些核酸酶能够识别特异的核酸序列，并在特定位点产生双链断裂，然后通过非同源末端连接或同源重组方式修复双链缺口，从而在编辑位点附近发生碱基的缺失、插入或替换，达到编辑基因的目的。在植物中主要是非同源末端连接方式修复断口，产生很多随机的缺失、插入或替换改变。

作物基因编辑技术往往借助常用的植物遗传转化方法，例如电穿孔、农杆菌介导的遗传转化等方法，对植物基因组特定位点进行插入、删除、替换等编辑，从而快速得到特定目标性状的品种，加快育种速度。遗传转化过程中往往会产生大量的不同基因型的基因编辑植株，包括双等位基因纯合突变，杂合体、嵌合体、双等位基因突变植物，这使快速筛选和检测纯合编辑植株面临很大挑战。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速鉴定二倍体T₀代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法，可快速有效去除二倍体T₀代基因编辑作物中的杂合体、嵌合体及双等位基因杂合突变，鉴定出双等位基因纯合突变，且成本较低。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种快速鉴定二倍体T₀代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法，包括以下步骤：(1)以二倍体T₀代基因编辑作物的DNA为模板，在靶标编辑位点下游设计特异性引物，进行PCR扩增，得PCR产物；

(2)对所述PCR产物进行变性和复性后，与T7E1酶混合后，在37℃孵育30min，终止反应，电泳后只有一个条带的为野生型或双等位基因纯合突变植株PCR产物；

(3)将待检测野生型或双等位基因纯合突变植株PCR产物与已知野生植株的PCR产物等量混合后变性和复性，与T7E1酶混合后，在37℃孵育 30min，终止反应，电泳后只有一个条带表示待检测植株为野生型，电泳后有三个条带表示待检测植物为双等位基因纯合突变植株。

优选的，步骤(1)在靶标编辑位点下游500～800bp处设计特异性引物。

优选的，步骤(1)所述PCR扩增的反应体系以20μl计算，包括：模板 1μl，10mMdNTPs 0.5μl，上下游引物各0.5μl，10×Ex Taq Buffer2μl，Ex Taq 0.1μl，余量为水。

优选的，步骤(1)所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性1min； 94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤(2)所述变性和复性的反应体系包括：10×NEBuffer22μl，待检测植株的PCR产物4μl和Nuclease-free Water 13.5μl。

优选的，步骤(2)所述变性和复性的反应程序包括：95℃5min；90℃ 30s，85℃1s，每个循环降0.1℃，600个循环；4℃保存。

优选的，经过所述变性和复性的PCR产物与T7E1酶的体积比为19.5:0.5。