[发明专利]一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试纸条、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试纸条，其特征在于：所述试剂条包括硝酸纤维素膜和抗体-红色乳胶微球标记物一体垫，所述抗体-红色乳胶微球标记物一体垫位于硝酸纤维素膜的下方，所述抗体-红色乳胶微球标记物一体垫带有颜色的一端与硝酸纤维素膜连接。

2.如权利要求1所述的一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试纸条，其特征在于：所述抗体-红色乳胶微球标记物一体垫的制备方法如下：

（1）、红色乳胶微球的清洗、活化

量取粒径为400nm红色乳胶微球，按照每100μL加入900μL 的比例加入MES缓冲液（50mM，pH6.0）超声混匀，15000rpm离心15min,弃上清，留沉淀，如此操作两次，沉淀中加入1000μLMES缓冲液（50mM，pH6.0）复溶，超声混匀，分别加入NHS和EDC，使其终浓度为1mg/mL，室温孵育30min，15000rpm离心15min,弃上清，留沉淀，沉淀用10mL硼砂缓冲液（0.1mol/LNa2B4O7，所述硼砂缓冲液的pH8.5）重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球；

（2）、抗体-红色乳胶微球标记物制备

取A 族链球菌单克隆抗体加入步骤（1）制备的活化后的乳胶微球中（终浓度为0.5～1ug/mL），缓慢混匀，室温孵育6-10h, 17000-19000 r/min离心 10 min，弃上清；沉淀用10mL含有0.5%-1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，超声后重复离心1次，去上清；沉淀如上述方法重悬，即为A族链球菌抗体-红色乳胶微球标记物，4℃放置备用；

（3）、含抗体-红色乳胶微球标记物一体垫的制备

玻璃纤维的预处理：将玻璃纤维用处理液浸泡，晾干后裁切成1.4cm*30cm的条式备用；所述处理液为pH8.0～9.0的Tris缓冲液、0.5mg/mL的BSA、0.15％吐温20、2％蔗糖；

在处理后的玻璃纤维结合垫上喷涂A族链球菌抗体-红色乳胶微球标记物，在1.4cm*30cm的条式玻璃纤维边缘只喷一条宽0.5-0.7cm长30cm抗体-红色乳胶微球标记物，喷涂量为50-60μL红色乳胶微球标记物，喷涂浓度为20%-50%，喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中37℃烘干，即制得含抗体-红色乳胶微球标记物一体垫，密封干燥保存备用。

3.如权利要求1所述的一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜的制备方法如下：

所述硝酸纤维素膜上包被A 族链球菌单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体，形成检测线和质控线；所述A 族链球菌单克隆抗体浓度为1.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG 抗体浓度为1.0mg/mL。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试纸条，其特征在于：还包括吸水纸和底板，所述硝酸纤维素膜粘贴在底板的中间位置，所述硝酸纤维素膜的上方与吸水纸粘贴。

5.一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试剂盒，其特征在于：包括检测卡和样本稀释液，所述检测卡包括相互扣合的卡体和卡盖，所述卡体和卡盖之间具有权利要求1-4任一项权利要求所述的试纸条。

6.如权利要求5所述的一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试剂盒，其特征在于：所述样本处理液由A液和B液组成，所述A液包括2M的亚硝酸钠溶液、0.01%吐温20、0.1‰苯酚红，所述A液为粉红色，B液包括1M的醋酸、0.01%吐温20，所述B液为无色。

7.如权利要求6所述的一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的试剂盒，其特征在于：所述A液和B液正确混合，则混合液体的颜色由粉红色变成无色，所述A液和B液没有正确混合，则混合液体的颜色不变色或深黄色。

8.一种高灵敏度检测A族乙型溶血性链球菌的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

（1）样本处理

将处理液中的A液加入到样本处理管中，再加入处理液中的B液，挤压样本处理管外壁使A液和B液混匀，立即将已采样的拭子放到样本处理管中，转动挤压拭子10次，静置1分钟，然后从样本处理管外壁挤干拭子，使裂解后的混合液尽量多的留在管内，弃去拭子；

（2）检测

a、取出检测卡，放在台面上；

b、向检测卡的加样处中滴加约80～100μL步骤（1）中样本处理管中的液体；

c、5分钟判读结果， 10分钟后结果无效；

（3）结果判读

a、阳性（+）：质控线和检测线各出现一条红线；

b、阴性（-）：只有质控线出现一条红线，检测线位置无红线出现；

c、无效：质控线位置无线条出现，说明操作失误或试剂失效。