[发明专利]高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株

权利要求书

1.高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，所述方法包括：

(1)采用GYM培养基对待测筑波链霉菌进行接种培养，培养完成后洗脱得到孢子悬液；

(2)将孢子悬液稀释，取稀释后的孢子悬液进行紫外-ARTP复合诱变，培养后或得突变株；

(3)采用GYM培养基培养突变株，保藏；

(4)将步骤(3)获得的突变单菌落转接至含有酿酒酵母的GYM培养基进行抑菌检测，选取抑菌圈大于对照组的突变菌株为高产他克莫司筑波链霉菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中将抑菌圈大于对照组的突变菌株进行发酵，测定他克莫司的产量，产量达100mg/L以上的，筛选为高产他克莫司筑波链霉菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所获得的高产他克莫司筑波链霉菌，重新作为初始菌株重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)将待测筑波链霉菌接种至GYM平板26～30℃培养5～7天，取颜色为红色或白色的孢子洗脱至生理盐水中，将洗下的孢子悬液过滤、离心后去除上清液，加入生理盐水重悬后，离心、重新洗脱一次，用生理盐水重悬作为孢子悬液；

(2)孢子悬液稀释至浓度为10⁷～10⁸个/mL，取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，26～30℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用ARTP诱变仪处理，处理方式如下：取菌体悬液5μL与等体积10％甘油混合于金属载片上并展开均匀，在10℃、10L/min工作气流量条件下使用ARTP诱变仪处理60s，之后将整个金属载片投入到装有990μL生理盐水的1.5mL EP管中，充分振荡，每个上述EP管中取100μL液体涂布于GYM固体培养基上，26～30℃避光培养直至获得突变株；

(3)突变株涂布于GYM固体培养基上，26～30℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；

(4)将酿酒酵母作为敏感菌株，接种于YPD液体培养基，26～30℃、200rpm培养18～24小时后，涂布于GYM固体培养基；将步骤(3)筑波链霉菌单菌落打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布毕赤酵母的固体培养基上，26～30℃培养18～24小时后，观测抑菌圈大小，挑选抑菌圈大于对照的菌株进行摇瓶发酵，通过HPLC精确测定他克莫司产量，筛选摇瓶发酵他克莫司产量达100mg/L以上的，即为高产他克莫司筑波链霉菌。

5.一株高产他克莫司筑波链霉菌菌株——筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomycestsukubensis ZJBH1901)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO：M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

6.如权利要求3所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)在微生物发酵制备他克莫司中的应用。

7.一种利用筑波链霉菌微生物发酵制备他克莫司的方法，所述方法包括：将所述筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)接种至发酵培养基，28℃、220rpm发酵培养，获得含他克莫司的发酵液，将发酵液经分离纯化，得到所述他克莫司；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖5～15g/L，淀粉20～30g/L，糊精30～40g/L，酵母粉5～7g/L，蛋白胨4～5g/L，K₂HPO₄ 1～2g/L，(NH₄)₂SO₄ 1～2g/L，MgSO₄ 1～2g/L，CaCO₃ 5～10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。