[发明专利]高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法及菌株

说明书

本发明涉及一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株及其在微生物发酵制备他克莫司中的应用。本发明筛选获得的一株高产他克莫司筑波链霉菌菌株——筑波链霉菌ZJBH1901(Streptomyces tsukubensis ZJBH1901)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2020年5月14日，保藏编号CCTCC NO：M 2020120，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明的有益效果主要体现在：(1)通过抑菌圈法高通量筛选产他克莫司菌种，能够快速直观地反映菌种产他克莫司的能力，提高了诱变育种的筛选效率；(2)采用紫外‑ARTP复合诱变方法获得的筑波链霉菌ZJBH1901，相对原始菌株S1，他克莫司产量提高了200％，能够作为基因工程菌的原始菌株；(3)通过本发明方法可以得到发酵周期明显缩短的菌株，对于工业生产有着巨大的意义。

(一)技术领域

本发明涉及一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，以 及筛选到的一株诱变株及应用。

(二)背景技术

他克莫司(Tacrolimus，FK506)是一种23元大环内酯类抗生素，临 床上主要作为治疗器官移植后排斥反应的免疫抑制剂使用。1984年，日 本藤泽公司研究所从日本筑波山土壤中分离出的筑波链霉菌 (Streptomyces tsukubensis)发酵液中首次提取得到了他克莫司。

研究表明他克莫司与细胞内细胞溶质受体(主要是FKBP12-)相互 作用时，钙调神经磷酸酶的钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性受 到抑制。在这种情况下，钙调神经磷酸酶不再能使转录因子(例如NFAT) 去磷酸化，而去磷酸化的转录因子是控制T细胞增殖所必需的。因此， 他克莫司具有高效的免疫抑制活性(其免疫机制示意图参见图1)。

在发现他克莫司之前，临床上常用环孢素A(CsA)作为免疫抑制剂 来治疗器官移植后的排斥反应。CsA也是一种CaN抑制剂，免疫抑制机 制与他克莫司类似，但他克莫司的作用效果是CsA的100倍左右。同时 他克莫司可预防各种因器官移植引起的排斥反应，且不良反应较环孢素A 少。1993年，他克莫司胶囊在日本首次批准上市，商品名是“普乐可复”。随后其经FDA获准后，相继在多个国家上市使用。他克莫司上市以来已 广泛用于肝、肾和骨髓移植的急慢性排斥治疗，已成为临床上肝、肾移植 后治疗排斥反应的一线药物。

当前全世界范围内由于肝病、肾病等原因需要移植器官的患者数量逐 年增加。中国每年需要器官移植的患者人数大概约有30万人。广阔的市 场前景使研究他克莫司提产具有巨大的医学意义和经济价值。他克莫司的 化学结构复杂，目前多采用微生物发酵法生产，因此筛选优秀的他克莫司 高产菌株是重要的一个前提工作。传统育种是提高菌株次级代谢产物产量 的切实有效的方法。传统育种分为物理诱变、化学诱变、复合诱变及其他 一些方法。通过诱变育种会得到大量经诱变的菌株，若一一通过发酵检测 其产量费时费力。因此传统育种方法需要一种高效便捷快速的高通量筛选 方法来初步筛选，以提高诱变育种的效率。

抑菌圈法又称扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的 敏感菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈。随后根据抑菌圈大小判定 待测药物抑菌效价的一种方法。抑菌圈法操作便捷、简单易行、成本低廉、 结果准确可靠，被广泛用于抗生素等代谢产物菌种筛选的初筛，工具菌一 般采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如 抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来，为高通量筛选提供了基础。

(三)发明内容

本发明目的本发明目的是一种高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链 霉菌的方法，以及筛选到的高产他克莫司诱变株及应用。

本发明采用的技术方案是：

高通量诱变筛选高产他克莫司筑波链霉菌的方法，所述方法包括：

(1)采用GYM培养基对待测筑波链霉菌进行接种培养，培养完成后 洗脱得到孢子悬液；