[发明专利]一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用

权利要求书

1.一种非诊断目的的多核苷酸激酶检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQID：01所示，DNA2的序列如SEQID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；

S2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4DNA连接酶和RNaseH混合成检测溶液；

S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36-38℃反应40-50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶；

所述DNA1、DNA2、ATP、T4DNA 连接酶、RNaseH 和MB在所述检测溶液中的终浓度为90~110nM、90~110nM、0.45~0.55mM、2.0~2.2U/μL、0.02~0.04U/μL和180~220nM；

所述测定荧光强度的Ex/Em=450/521，扫描范围495~580nm，狭缝宽度10nm。

2.一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQID：01所示，DNA2的序列如SEQID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；

A2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链、MB、ATP，T4DNA 连接酶、RNaseH和脂质体混合均匀，室温下孵育25~35min后采用含1%胎牛血清的高糖培养基DMEM稀释，得到所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系；

所述DNA1、DNA2、ATP、T4DNA 连接酶、RNaseH 和MB在所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系中的终浓度为90~110nM、90~110nM、0.45~0.55mM、2.0~2.2U/μL、0.02~0.04U/μL和180~220nM；

所述DNA1、DNA2、ATP、T4DNA 连接酶、RNaseH 和MB的总质量与所述脂质体的质量比为1：2.5~3.5。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，其特征在于，所述脂质体根据薄膜分散法制备，其中胆固醇：卵磷脂的质量比为1：2。

4.一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系，其特征在于，根据权利要求2至3任一项所述方法制备。

5.一种根据权利要求4所述的多核苷酸激酶胞内成像监测体系的非诊断目的的应用方法，其特征在于，将所述多核苷酸激酶胞内成像监测体系加入到待测细胞中，36~38℃共孵育3.5~4.5h，再进行细胞核染色，在多维活细胞成像显微镜下观察拍摄。

6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述细胞核染色为采用Hoechst33342染色液染色25~35min。