[发明专利]一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用

说明书

本发明提供了一种多核苷酸激酶检测方法，包括以下步骤：S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森‑克里克碱基互补配对原则设计合成RNA‑DNA模板链，RNA‑DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；S2，将DNA1，DNA2，RNA‑DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4DNA连接酶和RNase H混合成检测溶液；S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36‑38℃反应40‑50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶。该检测方法背景信号低，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用，属于生化分析与诊断技术领域。

背景技术

多核苷酸激酶(PNK)可以将ATP分子上的γ-磷酸基团转运到核苷酸上从而磷酸化核苷酸分子。该过程在DNA复制，核酸代谢和DNA重组中发挥重要作用。有证据显示磷酸化是DNA连接酶修复损伤DNA的前提条件，多核苷酸激酶功能受阻会导致布鲁姆综合症、罗斯蒙-汤姆逊综合症、沃纳综合症、神经退行性疾病等疾病。另一方面，多核苷酸激酶的过度表达会引起活性氧的产生，导致慢性炎症。因此准确的监测多核苷酸激酶的意义重大。

传统的检测PNK活性的方法有放射性³²P标记法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法以及放射自显影法。上述传统方法存在很多缺点：对环境和人体有害，需要专业的操作人员。近年来有很多新的方法出现，但是这些方法普遍存在背景信号较高，重复性欠佳等问题。

发明内容

本发明提供了一种多核苷酸激酶检测方法、胞内监测体系及应用，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种多核苷酸激酶检测方法，包括以下步骤：

S1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；

S2，将DNA1，DNA2，RNA-DNA模板链混合杂交形成复合探针；复合探针与MB，ATP，T4DNA连接酶和RNase H混合成检测溶液；

S3，取检测溶液和待测样品，混合均匀，36-38℃反应40-50min后测定荧光强度，根据荧光强度定性或定量多核苷酸激酶。

作为进一步改进的，所述DNA1、DNA2、ATP、T4 DNA连接酶、RNase H和MB在所述检测溶液中的终浓度为90～110nM、90～110nM、0.45～0.55mM、2.0～2.2U/μL、0.02～0.04U/μL和180～220nM。

作为进一步改进的，所述测定荧光强度的Ex/Em＝450/521，扫描范围495～580nm，狭缝宽度10nm。

一种多核苷酸激酶胞内成像监测体系的制备方法，包括以下步骤：

A1，设计合成两个DNA片段DNA1和DNA2，DNA1的序列如SEQ ID：01所示，DNA2的序列如SEQ ID：02所示；根据沃森-克里克碱基互补配对原则设计合成RNA-DNA模板链，RNA-DNA模板链的序列如SEQ ID：03所示；设计合成DNAzyme的底物MB，MB的序列如SEQ ID：04所示；MB的5’端连接荧光基团FAM，MB的3’端连接淬灭基团BHQ1；