[发明专利]一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用

说明书

本发明涉及一种细菌来源的α‑L‑鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷中的应用。本发明中的α‑L‑鼠李糖苷酶FjRha的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因从约氏黄杆菌的基因组中克隆得到。该α‑L‑鼠李糖苷酶FjRha可以专一性水解人工底物和含有α‑1,6鼠李糖苷键的天然底物，可以高效特异性催化橙皮苷制备橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷，在酶用量8U/mL，pH 7.0，37℃条件下催化3g/L的橙皮苷生成橙皮素‑7‑O‑葡萄糖苷的转化率高达95％以上，该方法具有步骤简单，成本低廉，条件温和，环境友好等优点，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产橙皮素-7-O-葡萄糖苷中的应用，属于糖工程技术领域。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)，能够特异性水解糖苷、糖脂和其他天然产物的末端α-L-鼠李糖，在自然界中分布广泛，微生物是该酶的主要来源。α-L-鼠李糖苷酶可以有效地水解许多天然糖苷类物质，例如人参皂苷、柚皮苷、橙皮苷和芦丁等的末端鼠李糖苷键，作为生物催化剂，可用于使果汁脱苦、葡萄酒增香，或生物转化芦丁等黄酮类化合物生产具有更高应用价值的产品，是食品、医药等领域重要的糖苷水解酶类。

有关α-L-鼠李糖苷酶催化应用的研究，主要集中在真菌来源的酶类，对细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶研究较少。中国专利文献CN104312996A(申请号CN201410504753.6)、CN104762281A(申请号CN201510102927.0)、CN106191084A(申请号CN201610589986.X)CN107287223A(申请号CN201740468317.1)、CN108467858A(申请号CN201810110773.3)等分别公开了采用真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶用于水解鼠李糖苷化合物的生物催化。真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶，往往在原核的异源表达系统中产量低，主要通过原始菌株发酵或者酵母异源表达系统表达获得，如上述专利所述。但这些方法获得的α-L-鼠李糖苷酶通常与来源于宿主的其他糖苷酶，例如葡萄糖苷酶，密切共存；或者α-L-鼠李糖苷酶本身水解键型不专一，兼具水解其他糖苷键的活性，使用这种α-L-鼠李糖苷酶，会对催化底物上其他糖苷键非特异性水解，产生大量副产物，降低底物的利用度，增加有效产物的分离难度。因此迫切需要开发水解键型专一，并且适用于原核表达系统高效表达的细菌来源的鼠李糖苷酶，用于天然产物的水解修饰。

橙皮素-7-O-葡萄糖苷(Hesperetin-7-O-glucoside，H7G)是一类重要的产品，其主要作为底物用于酶催化生产新橙皮苷(Neohesperidin)，新橙皮苷再通过催化加氢生成新橙皮苷二氢查尔酮。橙皮素-7-O-葡萄糖苷也直接可通过催化加氢生成橙皮素二氢查尔酮-7-O-葡萄糖苷。新橙皮苷二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮-7-O-葡萄糖苷都是具有巨大应用潜力的食品添加剂，甜味很高且持续时间长，稳定性好，热量低，且不会影响人体的血脂和血糖水平，因此可广泛用于医药、食品和饲料工业。

生物催化法制备橙皮素-7-O-葡萄糖苷，因其步骤简单，条件温和，环境友好，具有很高的经济价值。生物催化法以橙皮苷(Hesperidin)为起始底物，通过橙皮苷酶或者鼠李糖苷酶水解除去橙皮苷的α-1,6鼠李糖苷键连接的末端鼠李糖，生成重要产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷。但是利用现有的橙皮苷酶或者鼠李糖苷酶催化，通常会由于酶的非专一性水解，水解掉除鼠李糖外的葡萄糖，生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷和橙皮素的混合物，致使目的产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷的产率很低，且难以和副产物橙皮素进行分离，不适合规模化应用。橙皮苷、新橙皮苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷的分子结构如下所示。他们均具有双氢黄酮结构，其中橙皮苷中L-鼠李糖以α-1,6糖苷键连接在葡萄糖基上，新橙皮苷中L-鼠李糖以ɑ-1,2糖苷键连接在葡萄糖基上，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的葡萄糖基上没有鼠李糖。