[发明专利]一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法

权利要求书

1.一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；

(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；

(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；

(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗；

步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片；

步骤(1)中，所述预培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基；

步骤(1)中，暗培养的时间为24h；

步骤(3)中，农杆菌侵染液的OD₆₀₀在0.3-0.5之间，侵染时间为8-10min；

步骤(3)中，所述窄冠黑杨11号叶盘分化培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基；

步骤(3)中，所述一号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L和GA₃0.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基；

步骤(4)中，所述二号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L、cef 300mg/L-500mg/L、和GA₃0.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基；

步骤(4)中，所述生根培养基为添加有25-30g/L、琼脂5-7g/L、NAA 0.1mg/L-0.2mg/L、IBA 0.1mg/L-0.2mg/L和活性炭0.5mg/L-1.0mg/L的1/2MS培养基。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(5)中，采用PCR和RT-PCR技术对生根的幼苗进行鉴定。