[发明专利]一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明的遗传转化方法包括：外植体选择及预培养、农杆菌侵染、诱导培养形成组培苗等过程，利用本发明的遗传转化方法可在短时间内培育出大量优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，不仅可以缩短转化时间，提高遗传转化效率，而且转化体系稳定，不受时间和季节的影响，可以大批量的为华北地区培育生产具有抗蛀干害虫性能的优良黑杨品系。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。

背景技术

杨树是世界上中纬度平原地区栽培面积最大的速生用材树种之一，具有生长快、产量高和易于更新的特点，也是对碳固定贡献最大的林木树种。从栽培面积上，我国杨树人工林面积已达700万公顷，位居世界首位。

随着杨树造林面积的不断扩大，单一品系的过度利用导致杨树病虫害愈演愈烈。据统计，我国森林因病虫害年损失约1.4亿亩，直接经济损失达880亿元。尤其是，天牛等蛀干害虫，由于其幼虫在树干内隐蔽为害，世代长且不整齐，受环境影响小，天敌种类少，采用化学、物理、生物防治等手段难度较大，一旦发生为害，造成的损失惨重。因此，培育抗蛀干害虫杨树新品系是杨树产业化可持续发展亟待解决的重要问题。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种重要的杀虫微生物，具有高度特异的杀虫活性，不仅对人类和牲畜没有危害，且不污染环境。采用基因工程手段将Bt基因转入植物且在植物体中进行表达，从而赋予了转基因植物抗虫性。当前研究表明，对天牛等鞘翅目害虫具有特异杀虫活性的主要是Bt886Cry3A基因。但是，通过实验发现将Bt886Cry3A基因转化杨树后，对天牛的控制并没有达到预期的效果。因此，改造Bt886Cry3A同源基因，并在杨树中实现高效表达从而获得抗虫型窄冠黑杨成为控制天牛为害的关键。

窄冠黑杨11号是由山东农业大学庞金宣、李际红等通过杂交选育出的杨树优良新品种，该新品种树冠窄，冠幅比一般大冠杨树小1/2-1/3，生长快、材质好，耐盐碱能力较强，是华北地区主栽杨树品系。目前还未见有通过将抗虫基因转入窄冠黑杨11号以提高其抗蛀干害虫能力的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。采用本发明的方法，可以在短时间内培育出优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，提高了遗传转化效率，而且转化体系稳定，外源抗虫基因转入杨树之后，能够持续高表达抗虫毒蛋白，杀虫效果显著。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；

(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；

(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；

(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗。

优选的，步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片。