[发明专利]一种制备类泛素探针的多肽荧光底物方法

说明书

本发明提出了一种功能性多肽的合成方法。该方法包括：将粗肽的碳端氨基酸与Gly‑AMC进行缩合反应，以便获得所述多肽，所述缩合反应是在缩合剂的活化下进行的，所述缩合剂包括选自HCTU、DIC、HOBT、PyAOP、PyBOP、HBTU、HATU和HOAT的至少之一。该方法操作简便，所制备的多肽荧光底物产量大，纯度高，成本低，利于荧光试剂的商业化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及制备类泛素探针的多肽荧光底物方法。

背景技术

Cbz-RLRGG-AMC一种多肽片段的荧光底物。它的主体由蛋白翻译后修饰-泛素C末端5个氨基酸残基Arg-Leu-Arg-Gly-Gly构成的序列。该序列的N端裸露氨基由Cbz(苄氧羰基)保护基进行选择性保护，而C端连接AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)荧光分子。该底物在遇到去泛素化水解酶，如异肽酶(IPaseT)以及其他泛素C末端水解酶(UCHs)时，能够模拟野生型泛素链在末端甘氨酸处发生酰胺键水解断裂，从而释放AMC分子显著增强其发出的荧光，这样通过荧光就能够精确测定水解效率，确定酶活。泛素Cbz-RLRGG-AMC作为去泛素化酶的荧光检测试剂，实测去泛素化水解酶的催化水解效率(Kcat/Km)能够达到95M-1s-1。基于Cbz-RLRGG-AMC的荧光特性，该多肽荧光底物被作为高通量筛选工具，被广泛用于去泛素化酶抑制剂的开发和靶向去泛素化酶的小分子和多肽药物的筛选。

发明内容

本发明提出了一种多肽的合成方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将粗肽的碳端氨基酸与Gly-AMC进行缩合反应，以便获得所述多肽，所述缩合反应是在缩合剂的活化下进行的，所述缩合剂包括选自HCTU(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、PyAOP(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)的至少之一。根据本发明实施例的方法，操作简便，所制备的多肽荧光底物产量大，纯度高，成本低，利于荧光试剂的商业化。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述缩合剂为HCTU、PyAOP或HATU和HOAT。发明人发现，所述缩合剂为HCTU、PyAOP或HATU和HOAT，多肽的产率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述缩合剂为HATU和HOAT，所述HATU和HOAT的物质的量比为1:1。发明人发现，当缩合剂为HATU和HOAT的组合，且二者的物质的量比为1：1时，多肽的产率提高显著。

根据本发明的实施例，所述缩合剂为PyBOP、PyAOP、HCTU、HATU和HOAT或HBTU和HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIEA(N,N-二异丙基乙胺)的条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述缩合剂为HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)的条件下进行的。

根据本发明的实施例，所述粗肽是通过Fmoc固相合成法合成的。

根据本发明的实施例，所述粗肽具有RLRGG的氨基酸序列，所述粗肽是通过如下方式获得的：以氯树脂作为固相载体，经缩合剂活化，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上，最后一个氨基酸用Cbz保护，经全保护切割后，获得所述粗肽。

根据本发明的实施例，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上是在温度为30～32℃下、HCTU活化下进行的。

根据本发明的实施例，利用含有20％哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc反应。