[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用

权利要求书

1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因Rihc-2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的；所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

2.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Rihc-2连接到质粒pPIC9K上，构建表达载体pPIC9K-Rihc-2，导入宿主菌。

3.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述基因Hac1连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-Hac1，导入宿主菌；所述基因PDI连接到载体pPICZC中，构建表达载体pPICZC-PDI，导入宿主菌；

所述载体pPICZC按如下方法构建：以F7质粒为模板，利用引物Cre-F和Cre-R扩增Tcre基因片段；以pPICZα质粒为模板，利用引物Ori-Paox-F和Paox-R扩增Pox基因片段，利用引物Cre-Taox-F和Taox-R扩增Taox基因片段，利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F扩增基因片段pP，利用引物ori-F和ori-R扩增基因片段Ori；以pPIC9K质粒为模板，利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R扩增HIS4基因片段；将上述Tcre基因片段、Pox基因片段、Taox基因片段、基因片段pP、基因片段Ori和HIS4基因片段共6个片段连接，获得载体pPICZC；

4.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌，其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌按如下方法构建：将表达载体pPIC9K-Rihc-2电转入宿主菌中，筛选得到单拷贝腺苷水解酶基因的工程菌，利用转化后载体扩增方法获得多拷贝腺苷水解酶基因的工程菌；再利用抗性可循环表达载体技术将Hac1基因和PDI基因整合进基因组，得到重组毕赤酵母工程菌。

5.一种权利要求1所述重组毕赤酵母在制备嘌呤中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用方法为：以重组毕赤酵母经发酵培养获得的上清液浓缩后为催化剂，加入底物，以pH6.0-7.0的缓冲液为反应介质构成水解体系，在20-50℃下反应4～24h，反应液分离纯化，获得相应嘌呤；所述底物为腺苷或鸟苷。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述底物加入量以水解体系总体积计为100-500g/L。