[发明专利]一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用

说明书

本发明公开了一种重组毕赤酵母及在制备嘌呤中的应用，所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因Rihc‑2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的。本发明首次将腺苷水解酶在毕赤酵母中以分泌表达方式高效表达，并且组合应用了基因高拷贝、抗性可循环使用表达载体、HAC1和PDI基因导入等强化蛋白表达的策略，提高了重组酶的生产效率；本发明得到的菌株WC‑5在5L发酵罐中采用补料分批高密度发酵方法，腺苷水解酶蛋白表达量为500mg/L。发酵液上清粗酶液可应用于腺苷及鸟苷的水解反应。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组毕赤酵母工程菌及在制备嘌呤中的应用。

(二)背景技术

腺嘌呤和鸟嘌呤在医药工业上具有重要应用价值。腺嘌呤是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成，能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症，是生物体内不可或缺的一种化合物。另外，腺嘌呤也是很多药物的中间体，可用于生产植物激素6-BA、维生素B4、阿德福韦醋等。鸟嘌呤是抗病毒药阿昔洛韦和更昔洛韦合成的重要中间体，同时还可应用于临床治疗由免疫功能低下而引发的盲性巨细胞病毒性视网膜炎，此外还应用于器官移植、艾滋病以及恶性肿瘤的辅助治疗。

由于腺嘌呤和鸟嘌呤具有如此广泛的用途，近年来全世界的用量也正在不断地扩大，因此开发一种绿色环保，经济适用的腺嘌呤和鸟嘌呤工业化方法受到了广大化学生物工作者的关注。

目前，生产腺嘌呤和鸟嘌呤的方法主要有天然产物提取和化学法合成。由于天然产物提取存在效率低下、成本高等缺点，因此，工业化生产主要是采用化学法，但是，化学法一般都存在步骤比较长、反应条件苛刻、对环境不友好等缺点。以腺嘌呤为例，中国专利CN102321086A公开的制备方法，以乙酰次黄嘌呤为初始原料，先与三氯氧膦在N，N一二甲基苯胺催化下发生氯代反应，再通过高温高压氨化、精制等步骤得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，需要使用能耐受高温高压的特殊反应设备，对设备要求比较高，并且有安全隐患。另外，此方法产生的三废的量比较大，处理麻烦，对环境不友好。中国专利CN10288'7899A中公开的制备方法，以丙二酸二乙醋为初始原料与甲酰胺合成4，6一二羟基嘧啶，再通过硝化、氯代、氨化、还原、环合等步骤得到腺嘌呤。此方法的缺陷在于，反应步骤较多，原子经济性比较差，工业化价值较低。中国专利CN101125854A中公开的制备方法，利用高温液态水水解腺苷制备腺嘌呤，此方法的缺陷在于，水解腺苷需要在高温下进行，生成的副产物D一核糖在高温下容易变性而无法利用，非常不经济。中国专利CN103923083A中公开的制备方法，以腺苷为底物通过醋醉乙酰化后得到乙酰腺嘌呤和四乙酰核糖，再通过碱解、中和得到腺嘌呤。虽然此方法主产物腺嘌呤和副产物四乙酰核糖都能以较高的收率得到，但是此工艺复杂并且产生的三废较多。

鉴于此，目前函待提出一种反应步骤简单、产量高、成本低、环保的制备腺嘌呤和鸟嘌呤的方法。酶法水解制备腺嘌呤和鸟嘌呤的工艺就具有这样的优势。

大肠杆菌表达系统是目前应用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，它最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低,因而广泛用在工业酶的表达生产上。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白加工修饰能力，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程，其产物往往形成没有活性的包涵体。例如，中国专利CN105802938A中公开的制备方法，用重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中表达腺苷水解酶，将腺苷溶于水中，加入腺苷水解酶进行反应，得到腺嘌呤。腺苷水解酶在大肠杆菌中进行表达，虽然方法简单，但是大肠杆菌表达的是胞内酶，细胞破碎成本高，且酶液中含有大量杂质，甚至含内毒素，不利于腺嘌呤、特别是食品和医药级腺嘌呤的分离纯化。