[发明专利]溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括了特异性检测溶藻弧菌的引物和探针，具体序列如下：

rpoS-F：5’ – CGTGGTTTCCGTTTCTCTACT – 3’；

rpoS-R：5’ – TTTCTTCTGCGGTCGGTTCGT – 3’；

rpoS-Probe：5’ – 6-FAM – CTCGCACGATCCGTCTACCTATCCACG – BHQ1 – 3’；

toxR-F：5’ – CCAGCAGTGGAGTTAGAAGCGA – 3’；

toxR-R：5’ – GCAAACAGGAAGCAGCAGAGAC – 3’；

toxR-Probe：5’ – VIC – CCGACTAAAACTCAGCCGAAGCCAGC – BHQ1 – 3’。

2.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备盒体；

2）配制检测试剂：

裂解液：终浓度100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris -HCl、1.5 mol/L NaCl、2% CTAB；

蛋白酶溶液：20 mg/mL Proteinase K；

抽提液：苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25 : 24 : 1

析出液：异丙醇；

洗涤液：75%v/v乙醇 ；

溶解液：灭菌超纯水；

PCR反应液：每19.5μL PCR反应液含有0.1μL 10mM rpoS-F引物；0.1μL 10mM rpoS-R引物；0.4μL 10mM rpoS-Probe；0.1μL 10mM toxR-F引物；0.1μL 10mM toxR-R引物；0.4μL10mM toxR-Probe； 10μL Premix Ex Taq；8.3μL双蒸水；

阴性对照：灭菌超纯水；

阳性对照：重组质粒pMD18-rpoS和重组质粒pMD18-toxR混合液，每种重组质粒浓度均为1×10⁸拷贝/μL；

3）将操作说明书、裂解液、蛋白酶溶液、抽提液、洗涤液、析出液、溶解液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述阳性对照的制备方法为：

（1）利用设计优化好的溶藻弧菌rpoS基因和toxR基因引物，以溶藻弧菌的DNA样品作为模板，按照普通PCR检测体系反应，然后将PCR产物琼脂糖凝胶电泳，并使用Gel ExtractionKit试剂盒将目的片段切胶回收后分别连接到pMD18-T载体上，转化至Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序验证；

（2）提取构建好的pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒，再用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水将两种质粒浓度分别稀释为2×10⁸拷贝/μL，再将两种质粒按照体积比1﹕1混合均匀，即得pMD18-rpoS和pMD18-toxR质粒混合液作为阳性对照（每种重组质粒浓度均为1×10⁸拷贝/μL）。

4.一种利用权利要求1所述的试剂盒判定溶藻弧菌的方法，其特征在于，具体为：阳性对照和阴性对照成立的前提下，若两个待测基因都出现扩增反应曲线，且Ct＜35，则判断为阳性；若35≤Ct≤40，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若两个待测基因均未出现扩增反应曲线或只有单个待测基因出现扩增反应曲线，以及如果Ct＞40，则判断为阴性。