[发明专利]溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明利用溶藻弧菌两个基因的保守序列分别设计一对引物，优化PCR反应条件和反应体系，建立起检测溶藻弧菌的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，在此基础上组装出简便、快速、特异性强、灵敏度高的溶藻弧菌检测试剂盒，该试剂盒对质粒的检测下限为5×10¹拷贝数/μL，对细菌纯培养物的检测下限为1.8×10² cfu/mL。本发明克服了单探针法在检测同属近缘细菌时可能存在的假阳性，可实现复杂样品基质中目标病原菌的特异性检测，因而在溶藻弧菌的流行病学调查、溶藻弧菌所致疾病的快速诊断、以及水产品质量安全监测等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种鱼类致病菌的检测领域，具体涉及一种溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种革兰氏阴性的嗜盐弧菌，无芽孢、荚膜，是多种海水养殖动物的条件致病菌，如大黄鱼、斜带石斑鱼、鲑点石斑鱼、大菱鲆、褐牙鲆、南美白对虾、贝类、黄鳍鲷、锯缘青蟹等，对海水养殖业造成巨大的经济损失；同时溶藻弧菌可通过海产品感染人类，引起腹泻和食物中毒。因而，溶藻弧菌作为一种影响食品安全及人类健康的病原菌也日益受到关注。

目前对于溶藻弧菌病的防治主要依赖抗生素，而抗生素的大量使用带来了药物残留，病原菌耐药性增加，环境污染等严重问题。因而，对溶藻弧菌的检测和早起诊断显得尤为重要。虽然目前对溶藻弧菌的检测方法有多种，如细菌生化方法、免疫学检测方法（酶联免疫吸附实验，ELISA）、变性高效液相色谱、环介导恒温扩增技术、聚合酶链式反应（PCR）等，但这些方法存在耗时长、操作繁琐、准确率不高、灵敏度低等问题。因此需要建立一种快速、准确、特异性强和灵敏度高的检测方法，尽早对溶藻弧菌进行诊断、监控和预警，以减少该菌所致的病害发生及食品安全危害。

多重PCR检测技术是在一次反应中同时扩增一个模板的不同区域或扩增多个目的片段的PCR技术，具有快速、准确性高、特异性好的特点。而TaqMan探针实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增，TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析等优点，克服了常规PCR定性检测特异性差、灵敏度低等不足，目前已经应用于多种鱼类细菌性和病毒性疾病检测中，包括病毒性出血性败血症病毒（viralhemorrhagic septicemia virus, VHSV）、草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus,GCRV)、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda)、变性假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、及嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）。现在将多重PCR与荧光探针定量技术的整合应用，极大地提高检测的准确性、特异性、灵敏度，相较单探针具有更高的准确性和特异性，尤其在鉴别同属近缘不同种细菌时更具优势，克服了单探针法在检测同属近缘细菌时可能存在的假阳性，可实现复杂样品基质中目标病原菌的特异性检测，因而在溶藻弧菌的流行病学调查、溶藻弧菌所致疾病的快速诊断、以及水产品质量安全监测等方面具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种所述可特异性检测溶藻弧菌的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法。

为实现上述目的，采用以下技术方案：