[发明专利]重组腺相关病毒颗粒及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种重组腺相关病毒颗粒及其应用。重组腺相关病毒颗粒包含变异的AAV6衣壳蛋白，该变异的6型腺相关病毒衣壳蛋白，其中相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间。该重组腺相关病毒颗粒具有更强的感染能力，因而可以在更低的使用剂量下达到与常用剂量基本相同的感染效果，从而能有效降低在转导过程中对宿主细胞的损伤。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种重组腺相关病毒颗粒及其应用。

背景技术

利用转基因疾病模型进行人类疾病的研究由来已久，合适的转基因动物疾病模型不仅仅为疾病发病机理的研究提供重要的基础理论依据，而且避免了人体实验的造成的风险和伦理问题。转基因动物疾病模型的构建促进了人类对基因功能的了解和研究，同时促进了临床经验的积累和相应罕见病的药物开发。

转基因小鼠的构建一般策略是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，此方法非常便利，但是依赖于价格高昂、操作精细的显微注射设备及受过训练经验丰富的操作人员。目前关于通过腺相关病毒感染受精卵的相关研究非常有限，根据现有的文献报道显示，重组的腺相关病毒作为载体感染小鼠植入前胚胎制备转基因小鼠的方法比传统通过显微注射技术的方法优势在于操作简便，效率更高，在宿主组织里能达到高水平的基因表达，除此之外，已被证实其在应用于人的基因治疗方面有相对更低的基因毒性。

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒，它也是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒或疱疹病毒）来完成病毒包装。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。不同血清型的腺相关病毒在实验动物中有不同的组织亲和性。

AAV病毒，尤其是AAV6血清型，可以有效的感染受精卵。但是相对来说，文献公开报道的AAV6使用的剂量比较大，通常在40ul受精卵培养基中加入（6～9）×10⁹ vg总量的病毒颗粒，才能达到有效的受精卵感染。由于AAV高剂量下会对受精卵存在一定毒性，随着AAV使用剂量的增加，受精卵停止发育(死亡)的比例也会明显增加，此外受精卵移植的存活率也会降低，6×10⁹ vg感染胚胎移植存活率大概18%，而6×10⁷ vg感染移植存活率能达到30%，所以有效降低AAV感染受精卵使用量，一方面节省成本，另一方面可以提高受精卵感染后的存活率以及胚胎移植后的存活率。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种变异的AAV6（6型腺相关病毒）衣壳蛋白，其相对于相应野生型AAV6衣壳蛋白，所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有所述变异的AAV6衣壳蛋白中插入有氨基酸片段QTTDKYK，插入位点介于野生型AAV6衣壳蛋白的第588和589位氨基酸之间。

本发明的第二方面涉及一种重组腺相关病毒颗粒，其包含如上所述的变异的AAV6衣壳蛋白。

本发明的第三方面涉及一种腺相关病毒载体系统，其包含用于编码所述变异的AAV6衣壳蛋白的核酸片段。

本发明的第四方面涉及药物组合物，其包含如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的腺相关病毒载体系统，以及药学上可接受的赋形剂。

本发明的第五方面涉及一种将目的基因产物递送到受精卵或囊胚中的非治疗目的方法，包括：

将如上所述的重组腺相关病毒颗粒以（6～9）×10⁹ vg/40μL的浓度与受精卵或囊胚接触；

其中当所述受精卵或囊胚来源于人类时，其为自受精或核移植开始不超过14天的受精卵或囊胚。