[发明专利]一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒，其特征在于，包括用于检测基因标志物5-羟甲基胞嘧啶的试剂。

2.根据权利要求1所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒，其特征在于，所述基因标志物包括GPR132、LDAH、MSL2、LFNG、MAD1L1、GATAD2A、CASZ1、SUFU、RAD51B和/或CAMTA1。

3.根据权利要求1所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括葡糖基转移酶T4-β-GT、二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin、链霉素亲和素磁珠、带有叠氮修饰基团的二磷酸尿苷葡萄糖UDP-6-N3-Glu、spike in核酸、HIFIDNA聚合酶mix、鲑鱼精DNA、NGS通用扩增引物以及缓冲液。

4.根据权利要求3所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为含有Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20的缓冲液。

5.一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒的应用，其特征在于，包括对基因标志物5-羟甲基胞嘧啶含量的检测，以及利用基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶含量检测判断肝硬化患者发生癌变的情况。

6.根据权利要求5所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒的应用，其特征在于，对基因标志物5-羟甲基胞嘧啶含量的检测包括以下步骤：

步骤1：提取患者样品血浆的cfDNA；

步骤2：将提取的cfDNA进行片段长度检测；将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐；

步骤3：将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；

步骤4：通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将带有叠氮修饰基团的二磷酸尿苷葡萄糖UDP-6-N3-Glu的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

步骤5：通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；

步骤6：通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；

步骤7：通过使用含有Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20的缓冲液多次洗涤去除未结合的DNA片段；

步骤8：以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；

步骤9：对测序文库进行质量检查；

步骤10：将一定数量含有不同barcode的文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果。

7.根据权利要求5所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒的应用，其特征在于，利用基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶含量检测判断肝硬化患者发生癌变的情况包括以下步骤：

步骤a:对测序数据进行分析，使用FPKM(Fragment Per Kilobase per Million)进行测序深度的均一化处理，测定基因标志物5-羟甲基胞嘧啶含量；

步骤b：对步骤a中所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量进行数学关联，得到一个诊断分值wdscore；步骤c:将诊断分值wdsocre与临床血清学检测结果AFP及DCP结合，得到AD-wdscore；；

步骤d：以本发明所述试剂盒提供的能够区分肝癌、肝硬化样品中基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量诊断分值AD-wdscore的阈值为标准，获得受试者检测结果。

8.根据权利要求7所述的用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒的应用，其特征在于，所述AD-wdscore值大于3.382203表明该受试者患有肝癌。