[发明专利]一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒及其应用

说明书

本发明提出一种用于检测5‑羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒及其应用，通过试剂盒对基因标志物5‑羟甲基胞嘧啶含量的检测，以及利用基因标志物中5‑羟甲基胞嘧啶含量检测结果判断肝硬化患者发生癌变的情况；使得本发明的试剂盒应用于肝癌检测的情况下准确度较高，能够快速反应，对肝硬化检测和肝硬化转为肝癌的动态监测有较高的灵敏度和特异性；操作性强，仅通过采取静脉外周血即可进行检测；相较于常规组织活检技术，本发明无侵入性，可进行频繁多次检测；本发明所述试剂盒检测费用较低，受试者用户可接受度较强。

技术领域

本发明涉及试剂盒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒及其应用。

背景技术

肝硬化是临床上常见的慢性进行性疾病，其发病主要以肝炎病毒感染后肝硬化为主。通常会伴随出现上消化道出血、肝性脑病、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症，肝硬化转为肝癌的几率高达70％，因此，肝硬化不仅被视为肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中期。据世界卫生组织统计，因肝硬化致死人数仅次于恶性肿瘤、心脑血管病和意外事故，居死亡原因第5位。目前对于肝硬化患者这类肝癌的高危人群，临床上主要通过血清肿瘤标志物检测，如检查血液中甲胎蛋白(AFP)含量、异常凝血酶原(DCP)等，但两者灵敏度分别为不足60％和44％。同时，AFP水平容易受到怀孕或其他疾病因素的影响，如一些慢性肝炎患者中，血清AFP也会升高，这会导致易出现假阳性的检测结果。此外，目前临床上还会采取超声检查和CT检查等影像学手段进行诊断，但是单纯的B超或CT检查存在着漏诊率较大，而且影像学操作易受操作者经验影响，对设备依赖性较高，且费用昂贵，不适宜频繁使用。这使得多数患者不能得到早发现早治疗的机会，失去了最佳治疗时期。

因此，寻找新的肝硬化标志物，尤其是对于肝硬化晚期转为肝癌的高危人群的诊断标志物，这能有效提高早期肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，对于降低病死率意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提出一种检测诊断高，检测便宜，并且可以应用于肝癌检测的试剂盒及其应用。

为达到上述目的，本发明提出一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒，包括用于检测基因标志物5-羟甲基胞嘧啶的试剂。

进一步的，所述基因标志物包括GPR132、LDAH、MSL2、LFNG、MAD1L1、GATAD2A、CASZ1、SUFU、RAD51B和/或CAMTA1。

进一步的，所述试剂包括葡糖基转移酶T4-β-GT、二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin、链霉素亲和素免疫磁珠、带有叠氮修饰基团的二磷酸尿苷葡萄糖UDP-6-N3-Glu、spikein核酸、HIFIDNA聚合酶mix、鲑鱼精DNA、NGS通用扩增引物以及缓冲液。

进一步的，所述缓冲液为含有Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20的缓冲液。

本发明还提出一种用于检测5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂盒的应用，包括对基因标志物5-羟甲基胞嘧啶含量的检测，以及利用基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶含量检测判断肝硬化患者发生癌变的情况。

进一步的，对基因标志物5-羟甲基胞嘧啶含量的检测包括以下步骤：

步骤1：提取患者样品血浆的cfDNA；

步骤2：将提取的cfDNA进行片段长度检测；将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐；

步骤3：将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；

步骤4：通过葡糖基转移酶T4-β-GT，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

步骤5：通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素；