[发明专利]一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用

权利要求书

1.一种多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于包含基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物AZD5582；

所述的多维多靶点复合纳米粒子的制备方法，包含如下步骤：

（1）传代培养：将人或动物细胞进行传代培养，获得第二代至第四代的人或动物细胞；

（2）将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞；

（3）步骤（2）制得的表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞大量培养，收集细胞，然后超声破碎细胞，得到破膜的细胞匀浆液；

（4）通过蔗糖密度梯度离心方法对步骤（3）制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液；

（5）将AZD5582溶液与步骤（4）制得的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液混匀，然后20KHZ超声30秒，间隔30秒，再次重复超声操作，如此重复6次；

（6）超声处理后，立即放入细胞培养箱中孵育1小时，以促进基于细胞内质网来源的生物纳米粒子膜修复；

（7）孵育结束后，将混合液以100000g超速离心3小时，倒掉上清液，再用PBS洗涤，同条件离心，沉淀物即为同时负载TRAIL和AZD5582的多维多靶点复合纳米粒子；

步骤（1）中所述的人或动物细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞或羊膜间充质干细胞中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：

步骤（2）中所述的病毒为慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。

3.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：

步骤（2）中所述的转染的具体操作为：

将状态良好的P₂~P₄代脐带间充质干细胞，以1×10⁶个/孔接种于六孔板，37℃，5%CO₂细胞培养箱过夜；离心去除培养基，然后加入含有表达人源TRAIL蛋白的慢病毒和polybrene的DMEM/F-12培养基，孵育6~24小时；孵育后离心去除培养基，加入含有10% FBS的DMEM/F12新鲜培养基继续培养2~3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到表达TRAIL蛋白的脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：

所述的表达人源TRAIL蛋白的慢病毒的MOI为2，用量为10~30 μL/mL；

所述的polybrene在DMEM/F-12培养基中的浓度为5~20 μg/mL。

5.根据权利要求1所述的多维多靶点复合纳米粒子，其特征在于：

步骤（4）中所述的蔗糖密度梯度离心方法的具体操作为：

将破膜的细胞匀浆液加入到蔗糖密度梯度的液柱上层，在4℃条件下，以100000g超高速离心3小时；然后将液柱中的液体由上至下等体积取出，收集第6~8次取出的液体，即为含有表达TRAIL的基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液。

6.权利要求1~5任一项所述的多维多靶点复合纳米粒子的制备方法，其特征在于包含如下具体步骤：

（1）将AZD5582溶液与基于细胞内质网来源的生物纳米粒子溶液混匀，然后20KHZ超声30秒，间隔30秒，再次重复超声操作，如此重复6次；

（2）超声处理后，立即放入细胞培养箱中孵育1小时，以促进基于细胞内质网来源的生物纳米粒子膜修复；

（3）孵育结束后，将混合液以100000g超速离心3小时，倒掉上清液，再用PBS洗涤，同条件离心，沉淀物即为同时负载TRAIL和AZD5582的多维多靶点复合纳米粒子。

7.权利要求1~5任一项所述的多维多靶点复合纳米粒子在制备癌症防治药物中的应用。