[发明专利]一种细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用

说明书

本发明属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。本发明将表达人源TRAIL蛋白的病毒转染人或动物细胞，得到表达人源TRAIL蛋白的人或动物细胞，然后大量培养，收集细胞，超声破碎细胞，通过蔗糖密度梯度离心方法对制得的破膜的细胞匀浆液进行超速离心，分层吸出内质网提取物溶液，得到基于细胞内质网来源的生物纳米粒子。本发明提供的多维多靶点复合纳米粒子，包含上述基于细胞内质网来源的生物纳米粒子和致敏癌细胞凋亡应答活性小分子药物，该复合纳米粒子制备工艺简单，成本低，治疗肿瘤高效安全，药物用量低且无毒副作用。

技术领域

本发明属于天然生物纳米材料和肿瘤治疗领域，具体涉及一种基于细胞内质网来源的生物纳米粒子、多维多靶点复合纳米粒子及制备与应用。

背景技术

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumour necrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL))，是一类具有凋亡诱导活性的细胞因子，其与靶细胞表面的死亡受体4或5(DR4/5)结合，募集胞浆内接头蛋白FADD(Fas associated deathdomain containing protein)和半胱天冬酶原8(procaspase 8)，导致caspase 8酶原被激活(CASP-8)；至此，CASP-8可直接激活终末凋亡效应酶 CASP-3、CASP-6、CASP-7；CASP-8也可通过切割激活细胞内BID为t-BID，激活CASP-9介导的内源性线粒体凋亡通路，最终激活终末凋亡效应酶CASP-3、 CASP-6、CASP-7，引起肿瘤细胞凋亡。TRAIL具有广谱抗癌潜能，它特异性地诱导肿瘤细胞和癌细胞凋亡，而通常情况下对正常细胞无影响，因此受到人们的热切关注。重组可溶型TRAIL(rTRAIL，rT)已被证明可有效诱导癌细胞凋亡，但临床I期试验证实其血液清除率很高，半衰期少于30分钟，其较低的稳定性和生物利用度极大地阻碍了临床应用。近年，有学者用表达TRAIL的慢病毒转染细胞，以细胞或细胞释放的细胞外囊泡(EV)递送膜结合TRAIL治疗癌症，发现其效应显著优于rT。这种膜结合TRAIL改变了TRAIL在血液或细胞外基质中被迅速清除的命运，且TRAIL以聚集体的形式与死亡受体结合，增强凋亡信号的触发，可部分克服抗性癌细胞对TRAIL的耐药性。我们前期研究显示，经转染后的MSC可以高表达TRAIL，并发现大量TRAIL富集在内质网(ER) 上。然而，目前尚无关于用内质网来源TRAIL治疗癌症的专利和报道。

内质网是蛋白表达的重要合成与加工场所，mRNA在粗面型内质网携带的核糖体上翻译，经由内质网合成多肽，修饰加工，产生具有一定结构和生物活性的蛋白质。许多研究表明，来源于抗原呈递细胞(APC)内质网的微粒体 (microsomes)，对病毒感染产生的免疫应答比相应APC的更强烈和持久，这说明内质网及其衍生微粒体上来源的蛋白可以具有显著的生物活性。

癌症难以治愈，重要的一个原因在于普遍存在的癌细胞对治疗药物的耐药性。而癌细胞耐药性的产生往往是由于其凋亡通路中关键调控因子的变异、缺失或过度表达。

多靶点多维度调控细胞内源性促存活因子或凋亡抑制剂的表达，是致敏癌细胞的TRAIL应答，解决其耐药性的一个重要策略。有研究表明，一种细胞内源性促凋亡因子Smac/Diablo的化学模拟小分子(AZD5582)，可特异性地与凋亡抑制剂(Inhibitors ofapoptosis proteins，IAPs)的BIR结构域结合，屏蔽掉抑制位点或使其泛素化降解，释放caspases，极大地促进凋亡信号的激活、传导及执行。AZD5582(AZD)可与XIAP、cIAP1和cIAP2的BIR3结合，特异性地诱导癌细胞凋亡，但其单独使用的治疗效果有限。

发明内容

为了克服现有技术中促凋亡蛋白(比如TRAIL)治疗癌症存在的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种细胞内质网来源的生物纳米粒子(ERN-T)的制备方法。