[发明专利]产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗

说明书

本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域，该产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白包括将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的产气荚膜梭菌ε毒素的第151位氨基酸突变为丙氨酸。相比于野生型，该产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白毒性显著降低且具有良好的免疫原性。该疫苗能够缓解灭活疫苗生产工艺复杂、成本高、抗原复杂、批间差异和副作用大等技术问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，产气荚膜梭菌可以导致创伤性气性坏疽以及人类食物中毒，还可以导致牛羊坏死性肠炎、羊快疫、牛羊肠毒血症和羔羊痢疾，因此对畜牧业具有巨大的威胁。产气荚膜梭菌主要分泌α、β、ε、ι这四种外毒素，通过分泌的外毒素的种类不同，产气荚膜梭菌可以分为A、B、C、D、E五个毒素型。

产气荚膜梭菌致病后具有发病急、病程短和死亡率高的特点，因此人或动物一旦发病容易发生猝死，因此接种疫苗是对产气荚膜梭菌导致的疾病的有效防控手段。

传统商业化疫苗主要为灭活疫苗，由D型产气荚膜梭菌C60-1或C60-2菌株使用甲醛灭活后与氢氧化铝胶佐剂混合制成。由于D型产气荚膜梭菌C60-1或C60-2菌株在培养时采用的培养基为厌气肉肝汤，而该培养基成分复杂，导致难于质量控制，因此制备得到的灭活疫苗批间差异大，难于质量控制；且疫苗中含有完整的产气荚膜梭菌，因此疫苗中除去有效的抗原外，杂蛋白含量较多；同时，灭活疫苗的毒素定量只能通过小鼠毒力试验测定，操作繁琐且定量不准；由于D型产气荚膜梭菌C60-1或C60-2菌株毒力较强，因此需要较高含量的甲醛来对菌株进行灭活，这就导致了疫苗制备过程中甲醛含量高，灭活时间长。从上述可以看出灭活疫苗还存在着许多的不足，依据中国兽医药品监察所的抽检效力检验数据，目前产气荚膜梭菌疫苗的疫苗效率检验不合格率高达37％。

ε毒素由B型和D型产气荚膜梭菌产生，其以前毒素的形式分泌于菌体外，全长296个氨基酸。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的λ蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族的成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素的毒力而成为第三强的梭菌毒素。因此，实现ε毒素的减毒以及构建相关减毒体，对于开发ε毒素基因工程减毒亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。

目前，已有关于产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的报道，如抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε毒素及其方法与应用(CN106008682B)和大量外文文献报道。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，同时加入促融标签，导致蛋白结构发生变化，免疫原性不好；同时ε毒素重组蛋白均在胞内表达，需要进行超声破碎及镍柱纯化等复杂的生产过程。因此一种能够作为疫苗抗原的产气荚膜梭菌ε毒素及其制备方法是目前市场需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，相比于野生型，该产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白毒性显著降低且具有良好的免疫原性。

本发明的第二目的在于提供一种上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白的制备方法。

本发明的第三目的在于提供一种包含上述产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白或能够表达其的前体疫苗。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白，包括：将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的产气荚膜梭菌ε毒素的第151位氨基酸突变为丙氨酸。