[发明专利]一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法。本发明提供了一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法，包括如下步骤：将人全长TRPM4基因片段克隆到pAntigen Mem载体，筛选阳性克隆；提取质粒，转化感受态DH10菌株，挑选阳性克隆；抽提杆粒，在杆状病毒表达系统中产生P3杆状病毒；将P3杆状病毒转导入HEK293S GnTI^‑细胞，诱导表达，收集纯化药物靶点。之后，根据针对高血压的TRPM4药物靶点，有利于相应的特异性小分子抑制剂和相关抗体的设计，以用于高血压等心血管疾病的治疗。本申请所述的针对高血压的药物靶点表达和纯化方法能生产具有正常生理活性，产量达毫克级别的针对高血压的药物靶点，促进相应的相关抗体研发。

技术领域

本发明涉及高血压药物技术领域，具体地，涉及一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法。

背景技术

心血管疾病(CVD)，如高血压，中风和冠状动脉疾病，是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，已成为一个日益迫切的重大公共卫生问题。其中，高血压作为最常见的心血管疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势，抗高血压药物的临床应用也在不断发展和更新。

临床用于高血压治疗的药物主要有钙拮抗剂(CCB)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、β-受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)及利尿降压药等，这些药物均有不同程度的毒副作用，存着在很大的应用局限性。因此，我们亟需寻找针对高血压新的药物靶点，同时为开发一种新型、靶点特异、选择作用较强且副作用小的靶向药物提供重要的结构基础。

TRPM4是Ca²⁺激活的非特异性的阳离子通道，在心血管系统的许多细胞中均有表达，比如传导通路的心脏细胞、动脉和静脉平滑肌细胞。人类TRPM4的遗传变异体与多种心脏病传导障碍有关。研究表明，心肌肥大的高血压大鼠的心脏中TRPM4过度表达，TRPM4基因缺陷型大鼠的血压明显低于正常大鼠。同时，TRP channel家族成员之间的同源性很低，该家族成员比其他药物靶点中更容易地筛选出特异性的药物，限制了潜在的脱靶效应。因此，TRPM4通道是非常理想且极具潜力的新型抗高血压药物靶点。

为了解决现市面上的抗高血压药物缺乏特异性且副作用大的缺陷，针对高血压的关键药物靶点TRPM4，设计出相应的特异性小分子抑制剂和相关的抗体，以用于高血压等心血管相关疾病的治疗，具有重要的理论意义和实际应用价值。

发明内容

本申请人使用pAntigen Mem载体、哺乳动物细胞表达体系和优化的纯化系统，开发出一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法，能生产具有正常生理活性，产量达毫克级别的针对高血压的药物靶点，促进相应的相关抗体研发。

本发明的技术方案如下：一种针对高血压的药物靶点表达和纯化方法，包括如下步骤：将人全长TRPM4基因片段克隆到pAntigen Mem载体，筛选阳性克隆；提取质粒，转化药物靶点表达质粒转化感受态DH10菌株，挑选阳性克隆；抽提杆粒，在杆状病毒表达系统中产生P3杆状病毒；将P3杆状病毒转导入HEK293S GnTI^-细胞，诱导表达，收集纯化药物靶点。

所述人全长TRPM4基因片段编码第1-1214号氨基酸序列，其氨基酸序列如sequence No.1所示。

转导时，HEK293S GnTI^-细胞密度为2.0-3.0×10⁶细胞/ml，P3杆状病毒加入体积为细胞液的1/10。

细胞培养使用带挡板的烧瓶。

转导12-24h后，向细胞液中加入丁酸钠至终浓度为10mM。

转导12-24h后，细胞培养温度降至30℃。

人全长TRPM4基因片段编码的Sequence No.1的蛋白作为高血压的药物靶点的应用。