[发明专利]一种高效贯序诱导巨噬细胞体外极化的方法

说明书

本发明公开了一种高效贯序诱导巨噬细胞体外极化的方法，包括以下步骤：S1使用10％FBS和β巯基乙醇的RPMI1640培养基对THP‑1细胞进行扩增增殖培养；S2使用含HPL的PBS和培养基对THP‑1细胞进行诱导前预处理；S3在5％HPL且不含β巯基乙醇的RPMI1640培养基中，采用低浓度的PMA缓慢诱导THP‑1细胞，使其贴壁分化为M0巨噬细胞，然后去除PMA；S4在5％HPL且不含β巯基乙醇的RPMI1640培养基中，使用LPS/IFN‑γ诱导M0巨噬细胞72小时以上，使之极化为M1；或者使用IL‑4/IL‑13诱导M0巨噬细胞72小时以上，使之极化为M2巨噬细胞。与现有技术相比，本发明先采用低浓度的PMA缓慢诱导THP‑1细胞，可保证THP‑1细胞分化的M0型巨噬细胞的未成熟状态，随后的M1/M2型巨噬细胞的最佳诱导极化时间为72小时以上，从而确保M1/M2型巨噬细胞的极化状态。同时，上述分化过程在无动物源性成分的环境下进行，能够有效保证巨噬细胞的极化效率。

技术领域

本发明涉及一种高效贯序诱导巨噬细胞体外极化的方法，属于巨噬细胞诱导极化技术领域。

背景技术

巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。

巨噬细胞作为免疫系统的重要组分，普遍存在于血液、淋巴和组织中，具有明显的异质性和可塑性，在体内外微环境影响下，极化成不同的表型，呈现出不同的功能。根据激活方式和分泌的细胞因子不同，巨噬细胞主要分为经典激活(Classicallyactivatedmacrophage,M1)和替代激活(Alternatively activated macrophage,M2)两大类型：M1型巨噬细胞可由脂多糖(lipopolysaceharides,LPS)和干扰素γ(IFN-γ)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导形成，通过释放高水平的促炎因子如白细胞介素-12(interleukin 12,IL-12)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和氧化代谢物如一氧化氮(nitricoxide,NO)，并高表达抗原呈递必需的细胞表面分子包括MHCⅡ及协同刺激分子CD80和CD86参与诱导Th1型免疫应答，直接吞噬和杀伤病原微生物或肿瘤细胞；而M2型巨噬细胞则由Th2型细胞因子(如IL-4、IL-13等)和巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导形成，通过分泌免疫抑制性细胞因子如IL-10和转化生长因子β(transforminggrowth factorβ,TGF-β)等发挥免疫调节的作用，并高表达精氨酸酶1(Arginase 1,Arg-1)、类几丁质酶3样分子3(chitinase 3-like 3,Chi3l3或称YM1)和类抵抗素α(resistin-like-α,Retnlα或称Fizz1)分子，参与寄生虫感染、组织修复、血管生成和肿瘤进展等。

经申请人研究，现有巨噬细胞极化方法主要存在以下问题：

1、传统的方法中对THP-1细胞分化为M0的过程中使用的PMA浓度很广(从2.5nmol到300nmol不等)，这直接影响了THP-1分化为M0的成熟状态，高浓度PMA可能会抑制 M2型巨噬细胞相关蛋白的表达。同时，在传统方法中，M0极化为M1/M2巨噬细胞的诱导时间也没有确定(从24小时到大于72小时不等)，这也造成了极化的M1/M2巨噬细胞的极化状态的不确定性。