[发明专利]一种针对EGFP标签的纳米抗体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程抗体技术，具体为针对EGFP标签的单域重链抗体，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白，可应用于检测抗体、富集纯化目的蛋白、靶向纳米材料等领域。

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术，特别是针对增强型绿色荧光蛋白单域重链抗体及其应用。

背景技术

1962年Shimomure等人首次从维多利亚多管发光水母分离出分子量约为27KD的绿色荧光蛋白，其晶体结构显示，它由11个β-折叠链形成一个β桶状结构，两端被短段的a螺旋所覆盖，发色团位于中心同轴的a螺旋上并与α-螺旋通过共价键连接，β桶和α-螺旋形成致密的结构域，完全包裹发色团，阻止其它蛋白进入发色团并使其不受溶剂猝灭效应的影响，因此，其发光性质稳定，热稳定性好，对一些还原剂、氧化剂、有机溶剂甚至蛋白酶等具有显著抗性。绿色荧光蛋白作为当前生命科学研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究与应用价值。还因其自主发光无毒性等特点，在分子标记和示踪成像技术方面有着独特优势。

作为已知的具有最小结合活性的纳米抗体，只有天然的重链可变区区域，与传统的抗体相比，其分子量较小，约为15KD；具有稳定可溶、易表达、免疫原性低、能够很好的识别隐藏表位等优点，在检测、诊断、治疗等领域应用广泛。因此，发展EGFP纳米抗体在基础研究中具有广泛应用。

本发明公开了一种可以与EGFP标签特异性结合的单域重链抗体，可以与HRP酶偶联作为检测抗体并用于对EGFP标签融合蛋白的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够与EGFP标签特异性结合的纳米抗体，可以被用于检测抗体从而检测EGFP标签的工具。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种EGFP纳米抗体，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。以及提供了一种还有如SEQ ID NO.2所示核酸序列的载体，和含有该载体的宿主细胞。

本发明提供了EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)表达载体的构建：表达载体pET-25b用NotI、NocI进行双酶切，以F-long与R-long为引物进行PCR扩增获得PCR产物，使用割胶回收试剂盒对目的基因和载体进行回收；按照EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明书构建表达载体，载体与各个片段的摩尔比例在1:2-1:3之间，并将连接产物钙转化至Rosseta感受态细胞中，37℃倒置培养过夜，菌落PCR验证插入片段；

(2)EGFP纳米抗体表达：将pET-25b-EGFP表达菌接种于培养基中培养，当OD600＝0.5左右时，向培养物中加入IPTG诱导剂于20℃进行诱导培养；收集菌体，用PBS重悬沉淀，超声破碎后收集上清，用Ni柱纯化获得EGFP纳米抗体。

本发明还提供了HRP酶偶联EGFP纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)HRP酶氧化：将HRP酶溶于HAc-NaAC溶液中，加入NaIO₄溶液，4℃避光反应20min；加入乙二醇，4℃避光终止反应20min，离心取上清进行透析；

(2)HRP酶标记：加入待标记抗体，4℃避光旋转混匀4h；加入CH₃BHNa，室温反应2h；再加入乙醇胺封闭未结合位点，室温反应30min；

(3)加入终饱和度45％的硫酸铵粉末，4℃静置2h；离心后弃上清用PBS重悬沉淀得到HRP酶标记抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：