[发明专利]大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用

权利要求书

1.一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-bvr，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61045，保藏日期2020年6月8日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

2.一种权利要求1所述大肠杆菌zjut-bvr在制备胆绿素还原酶中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：大肠杆菌zjut-bvr经种子扩大培养后，以体积浓度3％–5％的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的产酶培养基，于35–37℃、150–200r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6–1.0，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L的IPTG，于30–32℃、150–200r/min诱导培养至OD₆₀₀＝1.2–2.0，获得含胆绿素还原酶的培养液，将培养液分离提取，获得胆绿素还原酶；所述产酶培养基终浓度组成为：甘油15–20g/L，酵母浸出粉15–20g/L，NH₄SO₄ 3–5g/L，NaCl 3–5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 10–15g/L，KH₂PO₄ 2–5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5–1.0g/L，溶剂为去离子水，pH7.2–7.4。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述培养液分离提取的方法为：将培养液离心，收集菌体后用结合缓冲液重悬，加入溶菌酶，经超声波破碎细胞，再离心，收集上清液，上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥，获得胆绿素还原酶。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述结合缓冲液组成：50mmol/L Na₂HPO₄，300mmol/L NaCl，用1mol/L的NaOH调节pH至8.0。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述溶菌酶酶活20000U/mg，所述溶菌酶加入终浓度为1mg/mL。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述超声波破碎细胞条件为：冰浴下，功率200W，工作2s，间隔3s，工作200次。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述上清液经Ni-NTA柱层析纯化、透析、浓缩、冷冻干燥的方法为：Ni–NTA柱经蒸馏水冲洗后，用2个柱体积的结合缓冲液预先平衡，将上清液以1mL/min的流速上样，用1倍柱体积的洗涤缓冲液洗柱5–10次，至洗涤缓冲液中不含杂蛋白，再用洗脱缓冲液洗脱至A₂₈₀为0，收集洗脱液；将洗脱液于透析袋中，用结合缓冲液透析除去咪唑，透析液于超滤管浓缩，浓缩液于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素还原酶冻干酶粉；所述的洗涤缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为2mmol/L的咪唑；所述的洗脱缓冲液是结合缓冲液中添加终浓度为50mmol/L的咪唑。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于透析袋截留分子量为3.5kD；超滤管截留分子量3kD。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述大肠杆菌zjut-bvr种子扩大培养方法为：按体积浓度1％的接种量移取15％甘油水溶液冻存的大肠杆菌zjut-bvr菌液，或大肠杆菌zjut-bvr斜面菌体，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、150r/min摇床中培养至OD₆₀₀＝1.0–1.5，得扩大培养的种子液；所述的LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.2–7.4。