[发明专利]大肠杆菌zjut-bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌zjut‑bvr及其在制备胆绿素还原酶中的应用，所述的应用为：大肠杆菌zjut‑bvr经种子扩大培养后，以体积浓度3％–5％的接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的表达培养基，于35–37℃、150–200r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6–1.0，加入终浓度为0.75–1.25mmol/L的IPTG，诱导培养至OD₆₀₀＝1.2–2.5，获得含胆绿素还原酶的培养液，将培养液分离提取，获得胆绿素还原酶；本发明大肠杆菌经表达培养，获得含胞内活性胆绿素还原酶的菌体，培养液的酶活为0.267U/mL，经分离纯化获得活性为1.84U/mg的胆绿素还原酶。

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌，以及该菌株在制备胆绿素还原酶中的应用。

(二)背景技术

胆绿素还原酶(biliverdin reductase，简称BvdR，EC l.3.1.24)是在血红素代谢中，催化胆绿素还原生成胆红素的酶(代谢途径见附图1)。胆绿素还原酶广泛存在于哺乳动物及一些鱼类各种组织胞液内，在肝脏和肾脏中含量最高。近年来研究发现，胆红素是体内有效的抗氧化剂，参与氧化应激反应等，因此催化胆红素生成的胆绿素还原酶逐渐引起人们的重视。

在脊椎动物体内，血红素在细胞代谢中的重要作用显而易见，但以往认为血红素代谢产物不仅对机体无益，过量时还可对机体造成损害。如游离胆红素如果不能和葡萄糖醛酸充分结合并排出体外，就容易透过血脑屏障对神经系统造成损伤。血红素加氧酶(hemeoxygenase，简称HO，EC 1.14.99.3)是血红素分解代谢的第一步限速酶，将血红素氧化为胆绿素。近些年来，关于血红素加氧酶的功能以及与疾病的关系逐渐被人们认识，大量研究结果表明血红素加氧酶具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增生等生理效应。在血红素加氧酶研究中，酶的活性多采用检测血红素分解代谢终产物胆红素的生成量来计算，需要在酶反应体系中加入胆绿素还原酶。目前，测定所需的胆绿素还原酶一般都是从动物肝脏直接提取的方法获得，这种制备的胆绿素还原酶成本高，且活性不够理想，因此，用基因工程的方法制备胆绿素还原酶是一条经济有效的途径。此外，胆绿素还原酶还可以用于生物转化胆绿素制备胆红素。

目前，国内外已有不少利用大肠杆菌表达牛、大鼠、柞蚕基因来源的胆绿素还原酶的研究报道，将真核生物来源的基因在原核细胞中表达，往往存在产物以包涵体存在的缺点。目前未见关于利用大肠杆菌表达原核细胞来源的胆绿素还原酶的研究报道。将原核生物的胆绿素还原酶基因在大肠杆菌中表达，则具有表达效率高、胞内活性好等优点，可以降低生产成本。为此，本发明将集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803的胆绿素还原酶基因在大肠杆菌中表达，并经过紫外线诱变和筛选，获得一株产酶活性显著提高的胆绿素还原酶产酶菌株，该菌株可应用于发酵生产胆绿素还原酶。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌，经诱导表达培养后，从菌体内分离获得胆绿素还原酶。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株产胆绿素还原酶的大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-bvr菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61045，保藏日期2020年6月8日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

本发明所述大肠杆菌zjut-bvr菌株的获得包括以下步骤：

(1)依据NCBI上提供的bvdr基因序列经大肠杆菌偏好密码子优化，并在序列的5′端引入限制性内切酶EcoR I位点、3′端引入限制性内切酶SaI I位点，化学合成的含EcoRI/SaI I酶切位点的bvdr基因，DNA序列见SEQ ID No.1；