[发明专利]检测猪圆环病毒4型的引物探针组、试剂盒与iiPCR方法

说明书

本发明涉及检测猪圆环病毒4型的引物探针组、试剂盒与iiPCR方法，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PCV4上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PCV4下游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PCV4探针，所述PCV4探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有猝灭基团。本发明提供的引物探针组进行荧光热对流PCR(iiPCR)，可在半个小时内完成PCV4的检测，特异性好，灵敏度高，可在现场使用，具有重要的临床使用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及检测猪圆环病毒4型的引物探针组、试剂盒与iiPCR方法。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是一种基因组为环状、单链的DNA病毒，根据基因组特征，目前已发现PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种基因型。其中，PCV1可在猪群中检出，但不致病；PCV2是引起猪断奶后衰竭综合症的主要病原；PCV3是一种与母猪皮炎综合征和繁殖障碍相关的病毒；最新基因型PCV4可能与呼吸道症状、肠道症状以及猪皮炎与肾病综合征相关。由于该病毒尚未成功分离，因此，在临床中快速、精准的诊断对于该病的检测具有重要的意义。目前，该病毒已在我国多省份报道，临床检测主要依靠普通PCR、实时荧光PCR等实验室诊断方法。但现有检测方法存在反应时间长、敏感度低等技术缺陷，且存在需要贵重仪器、操作繁冗的不便。

发明内容

本发明的目的在于提供检测猪圆环病毒4型的引物探针组、试剂盒与iiPCR方法。本发明提供的引物探针组进行荧光热对流PCR(iiPCR)，可在半个小时内完成PCV4的检测，特异性好，灵敏度高，可在现场使用，具有重要的临床使用价值。

本发明提供了检测猪圆环病毒4型的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PCV4上游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PCV4下游引物和核苷酸序列如SEQID NO.3所示的PCV4探针，所述PCV4探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有猝灭基团。

优选的是，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

优选的是，所述猝灭基团包括BHQ。

本发明还提供了基于上述技术方案所述引物探针组的检测猪圆环病毒4型的试剂盒，所述试剂盒包括：酶混合液和含上述技术方案所述引物探针组的PCR反应液；所述酶混合液包括0.5U/μL的TaqDNA聚合酶、20mM的Tris-HCl、0.05mM的EDTA、0.05mM的DTT、体积百分含量为40％的甘油和体积百分含量为0.2％的Tween-20；所述PCR反应液包括：20μM的上游引物、20μM的下游引物、10μM的探针、10mM的Tris-HCl、5mM的dNTPs和ddH₂O。

优选的是，所述试剂盒为荧光热对流PCR试剂盒。

优选的是，每40μL所述试剂盒的反应体系包括15μL的酶混合液、20μL的PCR反应液和5μL的待测样品。

优选的是，所述待测样品的来源包括血清、组织、粪便、环境拭子。

优选的是，所述试剂盒的反应条件为：上孔温度95℃，下孔温度60℃，反应时间30分钟。

本发明提供了检测猪圆环病毒4型的引物探针组，适用于该病毒在现场的快速、精准检测。本发明以PCV4 REP基因为靶标，设计引物与探针，建立荧光热对流PCR方法，优化的PCR反应体系与反应条件，开发的试剂盒具有灵敏度高、特异性好，稳定性强等技术优势，同时可在临床现场使用，可大幅缩短反应时间，具有良好的临床应用价值。含本发明所述引物探针组的试剂盒可在半个小时内完成临床样品中PCV4的检测，克服了传统PCR反应时间长、敏感度低等技术缺陷，克服了荧光定量PCR需要贵重仪器、操作繁冗的不便，可在现场快速检测PCV4，具有重要的临床实用价值和广阔的市场应用前景。