[发明专利]一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用

权利要求书

1.一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：HJ009：5’-AAACTCAAAATGCTCACCGATG-3’；

下游引物：HJ010：5’-GACTTGATAAAACTCGCCCCT-3’。

2.根据权利要求1所述的鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对的片段大小为249bp。

3.权利要求2所述的鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对在制备检测鹅2型星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的试剂盒含有权利要求1所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和荧光定量PCR反应试剂。

6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述标准质粒的制备如下：

以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到重组质粒作为标准质粒。

7.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green I Master Mix和ddH₂O。

8.一种利用权利要求3-7任一项所述的荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；

将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；

构建荧光定量PCR反应体系进行扩增反应，收集待测样品的荧光信号；

对收集的荧光信号进行数据处理，得到Ct值和扩增曲线，若待检样品的Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判断为阳性；若待测样品无扩增曲线或无规则扩增曲线，无Ct值，判断为阴性。

9.根据权利要求8所述的利用荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为20μL，包括SYBR Green I Master Mix 10μL、HJ009 1μL、HJ010 1μL、ddH₂O 7μL、cDNA template 1μL。

10.根据权利要求9所述的利用荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下扩增10s、温度条件为59℃的下扩增20s、温度条件为72℃下扩增20s、并以此条件以及顺序进行40个循环。