[发明专利]一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用

说明书

本发明提供了一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用，所述引物对的核苷酸序列如下：上游引物：HJ009：5’‑AAACTCAAAATGCTCACCGATG‑3’；下游引物：HJ010：5’‑GACTTGATAAAACTCGCCCCT‑3’。本发明得到引物对的特异性强，对其他常见感染水禽的病毒均无非特异性扩增，灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，检测范围可达9个数量级，重复性好，批间批内变异系数为0.27％‑0.41％。并将引物对应用在试剂盒中，检测鹅2型星状病毒，能实现定量检测，能帮助了解病毒组织嗜性以及致病性机理，有助于疫苗的研制；另外，本发明中的PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用。

背景技术

星状病毒为无囊膜，单股正链RNA病毒，基因组全长约为6.8-7.9kb。5’非编码区(5’UTR)开始紧接着3个开放阅读框(ORF1a,ORF1b,ORF2)、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺苷酸尾巴，其中ORF1a与ORF1b编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白。国际分类学委员会根据感染宿主的不同将星状病毒科划分为两个不同的病毒属：哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属。鹅2型星状病毒作为禽星状病毒的一个新发现的种类，其流行规律尚不明确，高效灵敏的检测方法的建立有利于疾病的诊断与防治及流行规律的探索。目前对鹅2型星状病毒的检测方法主要有传统电镜观察、普通PCR、TaqMan探针荧光定量PCR等。但电镜检测对病毒样本浓度与纯度要求均较高且步骤繁琐成本高昂，不适用临床大样本的检测与监测。普通的PCR检测高效但灵敏度较低，也会导致无法定量。采用TaqMan探针荧光定量PCR具有高效灵敏的特征且可定量，但同样成本高昂不适用于临床大样本的检测与监测。

综上，在鹅2型星状病毒的检测领域，仍然存在亟待解决的上述问题。

发明内容

基于此，为了解决现有技术中普通PCR检测灵敏度低、成本昂贵，不适用于临床大样本检测与监测的问题，本发明提供了一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用，具体技术方案如下：

一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：HJ009：5’-AAACTCAAAATGCTCACCGATG-3’

下游引物：HJ010：5’-GACTTGATAAAACTCGCCCCT-3’。

进一步地，将所述鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对在制备检测鹅2型星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供一种荧光定量PCR检测的试剂盒，所述荧光定量PCR检测的试剂盒含有权利要求1所述的引物对。

进一步地，所述荧光定量PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和荧光定量PCR反应试剂。

进一步地，所述标准质粒的制备如下：

以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到重组质粒作为标准质粒。

进一步地，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green I Master Mix和ddH₂O。

进一步地，所述重组质粒需要在-20℃下保存。

另外，本发明还提供一种利用荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1.运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；