[发明专利]草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT‑PCR检测引物组、试剂盒及其应用。本发明设计得到草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT‑PCR引物组，并基于该引物组，通过特定法扩增体系和条件检测草鱼呼肠孤病毒II型。其PCR反应第一次扩增可以检测到10³稀释的cDNA浓度，第二次扩增可以检测到10⁴次稀释的cDNA浓度，特异性强，比现有国标中GCRVⅡ型病毒的检测敏感性更高。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT-PCR检测引物、试剂盒及其应用。

背景技术

草鱼养殖是淡水养殖业重要组成部分，草鱼产量在2015年水产养殖总产量占比20％。

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)会引起草鱼出血病，其严重影响了草鱼养殖业的健康发展，造成草鱼养殖户巨大的经济损失。草鱼呼肠孤病毒具有危害种类多、流行范围广、发病季节长和死亡率高等特点，草鱼出血病主要危害1～2龄草鱼，感染后死亡率最高可达60％～100％。除草鱼外，还能感染青鱼、鲢鱼、鲫鱼和麦穗鱼等多种鱼类，并且稀有鮈鲫感染后死亡率达到100％。

草鱼呼肠孤病毒具有双层衣壳和11个节段(S1～S11)双链RNA的基因组，无囊膜，二十四面体对称结构，病毒粒子直径大小为60～70nm。现已报道出有30多个呼肠孤病毒分离株，所有毒株总体上可分为3个基因型，即GCRV I型、II型和III型，代表株分别为873株、HZ08株和104株。根据研究人员开展的流行病学调查研究表明，当前导致流行和爆发的主要是草鱼呼肠孤病毒II型。因此，建立快速、特异和敏感的诊断方法对草鱼出血病II型病毒的研究和防治有重要意义。

GCRV II型致病性强，细胞敏感性差，对于监测技术规范来说，寻找合适的检测方法，才能最大程度检出病原，降低传播风险。免疫预防是当前最有效预防草鱼出血病的方法，其次是尽早检测并隔离感染源。由于草鱼呼肠孤病毒具有高度的传染性，因此能够早期检测出病毒并且尽早隔离病原能够降低草鱼出血病的发生和传播，极大程度地挽回经济损失。

目前常用的检测方法有RT-LAMP、聚合酶链式反应(PCR)和荧光定量PCR(qPCR)。RT-LAMP能够在现场使用，但是结果假阳性居多，结果不可靠。荧光定量PCR对仪器和实验员技术要求比较高，相对的成本也较大，不适合一般实验室使用。聚合酶链式反应(PCR)是最常用的一种检测手段，能够在短时间内针对某段基因扩大数百万倍，具有特异性高，敏感性强和快速的特点，但是当组织内病毒含量较低时，常因其灵敏度低，会作出假阴性的判断。实时荧光定量PCR比常规PCR方法更加灵敏，能检测到病毒含量较低的组织，但因为使用仪器和试剂成本较高，很多很实验并没有配备荧光定量PCR仪，无法作为常规的检测手段。

目前流行的检测手段已经满足不了草鱼呼肠孤病毒II型检测的需要，迫切需要更加敏感、便捷的检测方法，为草鱼呼肠孤病毒II型的快速检测和流行病学调查提供工具，使草鱼呼肠孤病毒II型得到有效的预防和控制。

发明内容

本发明的目的在于提供草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT-PCR引物组；

本发明的另一目的在于提供一种用于检测草鱼呼肠孤病毒II型的试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒II型的RT-PCR检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述引物组在制备草鱼呼肠孤病毒II型检测试剂中的应用；

本发明的另一目的在于提供上述RT-PCR检测方法在草鱼养殖中草鱼呼肠孤病毒II型的预防与流行病学调查中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

草鱼呼肠孤病毒II型巢式RT-PCR引物组，该引物组的核苷酸序列为：