[发明专利]一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞、制备方法及注射液

权利要求书

1.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为预先经过γ-干扰素IINF-γ联合肿瘤坏死因子TNF-α激活的免疫功能预授权型间充质干细胞。

2.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞注射液，其特征在于，所述注射液含有权利要求1所述免疫调节功能预授权型间充质干细胞，人体白蛋白和生理盐水。

3.一种免疫调节功能预授权型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将分离提取的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs预先与炎性因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子共培养，在培养过程中，γ-干扰素和肿瘤坏死因子对WJMSCs的免疫功能进行预先激活，以制备免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述用于共培养的脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs是从新生儿脐带中分离的华通胶，经组织贴壁培养及3D培养扩增的三代脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；

与炎性因子γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-a共培养完成后，对脐带华通胶间充质干细胞进一步有采用低氧培养处理加强免疫活性。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1:从新生儿脐带内分离华通胶组织，经组织贴壁培养及3D培养，得到脐带华通胶间充质干细胞WJMSCs；

S2:将γ-干扰素INF-γ、肿瘤坏死因子TNF-α和WJMSCs共培养，在培养过程中，利用γ-干扰素INF-γ和肿瘤坏死因子TNF-α联合激活WJMSCs，制得免疫调节功能预授权型PL-WJMSCs；

S3:将PL-WJMSCs低氧培养处理加强其免疫调节功能。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，从新生儿脐带内分离华通胶组织包括从新生儿脐带内血管间、血管周、羊膜下三部分分离胶样粘液，其具体包括如下步骤：

S11:无菌提取剖腹产产妇脐带，置于PBS缓冲液中，洗去脐带表面的血迹；

S12:将脐带剪成3-4cm小段，加入生理盐水或PBS缓冲液洗涤血凝块；

S13:剪开羊膜，再沿脐静脉腔剪开脐带，撕除脐静脉内膜和外膜，撕取静脉周围、脐静脉与动脉之间、脐动脉周围的疏松结缔组织，将剥离下来的疏松结缔组织收集，即得到脐带华通胶组织。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述组织贴壁培养及3D培养包括组织培养和3D培养；具有包括步骤：

S21:组织贴壁培养：将剥离下来的疏松结缔组织，剪成1立方毫米以下的组织块，放入无菌细胞培养瓶中贴壁培养，在细胞培养瓶中加入无血清培养基，把含有疏松结缔组织的细胞培养瓶放入37±1℃、体积分数为4-6％的CO₂、饱和湿度培养箱中培养，每2-4天半量更换无血清培养基，观察细胞生长情况；

S22:3D培养：当细胞培养瓶中贴壁培养的细胞铺满瓶底80％后，弃细胞培养瓶中的无血清培养基和剩余的组织块，加入PBS缓冲液清洗细胞培养瓶底，弃清洗液，在细胞培养瓶中加入胰蛋白酶消化30-90秒，待贴壁的细胞收缩后加入无血清培养基终止消化，形成细胞悬液；混匀该细胞悬液，将细胞悬液移入离心管中，(100-150)g离心，弃上清，再加入无血清培养基得到细胞悬液；混匀该细胞悬液，细胞计数，(100-200)g离心，弃上清，再加入水凝胶混匀，得到水凝胶细胞悬液，使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×10⁵细胞；

准备若干个新的细胞培养瓶，在新的细胞培养瓶中加入水凝胶细胞悬液以便在每个细胞培养瓶中接种细胞；向细胞培养瓶中加入交联剂，促进水凝胶形成胶胨状，在细胞培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基，将细胞培养瓶放置于37±1℃、体积分数为4-6％的CO₂、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天，每天观察细胞生长情况。