[发明专利]核酸检测芯片装置、核酸检测芯片及其制备方法

说明书

本发明涉及核酸检测技术领域，公开了一种核酸检测芯片的制备方法，包括制备修饰芯片、反应芯片和阀芯片，以及将反应芯片和阀芯片封接后与经过修饰的底板封接形成核酸检测芯片。还公开了核酸检测芯片和核酸检测芯片装置的结构。本发明可实现高灵敏、低成本、易操作和高准确率的核酸检测，可以实现SARS等冠状病毒、流感病毒等多种病原核酸检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及的是一种核酸检测芯片装置、核酸检测芯片及其制备方法。

背景技术

根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》(第六版)的推荐，目前新冠病毒(SARS-CoV-2)常规检测方法是RT-qPCR技术。RT-qPCR技术的应用首先需要纯化病毒核酸，检测人员需要较长时间直接接触暴露的高浓度病毒颗粒和基因组核酸，具有很高的被感染风险性，需要生物安全级别2级以上的实验室环境，从而限制了病人检测速度，无法满足新发突发传染病病原体的检测需求。另一方面，被纯化的核酸进行逆转录为cDNA，接着进行荧光定量PCR技术扩增，极容易产生假阳性信号。同时由于需要使用荧光定量PCR仪，限制了病毒核酸检测的易用性，无法实现实时快速高通量检测；而且RT-qPCR需要操作人员具有一定的分子生物学基础，由于新冠病毒的巨大传染性，其检测需要在具有一定防护等级的严格分区的PCR实验室进行，给由于疫情爆发而需要大量样本检测带来巨大难度。另外，由于核酸诊断存在一定程度的假阴性，因此需要有效地把新冠病毒和流感病毒等其他类似病症分开，以免病人的交叉感染。

核酸检测广泛应用于生物病原体感染尤其是病毒感染检测。由于待检样本中核酸含量极低，通常需要进行扩增，以获得足量待检测核酸，最后利用荧光、显色或电位信号作为报告系统。目前核酸扩增技术包括变温扩增技术如聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)、实时定量PCR(qPCR)、巢式PCR、逆转录实时定量PCR(RT-qPCT)等常规PCR扩增技术，和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)为代表的等温扩增技术等两大类核酸扩增技术。新冠病毒是正链RNA病毒，需要先将病毒ssRNA反转录为cDNA，然后才能进行变温或等温扩增。其中，实时定量PCR技术检测灵敏度可达单拷贝病原基因组，但需要借助昂贵的qPCR仪器；而其它等温扩增技术尽管扩增设备简单，但检测精度不高，而且容易产生非特异扩增而引起假阳性。

另一方面，识别DNA序列的Cas12等CRISPR蛋白被应用于核酸检测。2016年麻省理工学院的张锋教授发现Cas13a(C2c2)蛋白除了能切割靶RNA之外，还可以切割无关的ssRNA，张锋团队随即开发了基于CRISPR/Cas13a的核酸检测方法——SHERLOCK。2018年赵国屏/王金团队在研究Cas12a的作用机理时发现Cas12a可在Cas12a:crRNA:dsDNA三元复合体形成后切割任意ssDNA，并开发了核酸检测技术HOLMES。同一时间，加州大学伯克利的研究人员也开发了类似原理的核酸检测方法。这些方法尽快都能识别引物以外的核酸序列，但是对于更多核酸序列的识别和读取却因多个gRNA同时测量的难度而受到极大的限制。尽管这些基于CRISPR/Cas方法能够通过等温扩增等技术，实现单拷贝病原体基因组的高灵敏检测，但是它本身的检测浓度极限为10-12Mol/L～10-13Mol/L，极大地限制了检测灵敏度，尚需要微流控芯片等技术集成多个靶位点识别能力，提高灵敏度，减少假阴性结果。