[发明专利]一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种共表达L‑苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用。一种共表达L‑苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌，在表达菌株中转入L‑苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因而得。本发明工程菌中外源导入L‑苏氨酸醛缩酶基因与PLP合酶基因，两个酶共表达，PLP合酶过表达能够提高菌株内源性辅酶PLP的合成量，将共表达后的工程菌破碎制备粗酶液，然后将L‑苏氨酸醛缩酶和辅酶PLP共固定化制备的共固定化酶能够显著降低L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸生产过程中外源PLP的使用量，提高了L‑苏氨酸醛缩酶和PLP的使用效率，降低生产成本。本方法反应条件温和、绿色环保、生产工艺简单、重复利用效率高、成本低廉，在L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸生产中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用。

背景技术

L-syn-对甲砜基苯丝氨酸是一种重要的医药中间体，应用于多种抗生素的合成，如甲砜霉素、氟苯尼考等。

化学法合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸，大量使用硫酸铜，在高温强碱条件下利用金属离子的络合作用生成两种syn式的产物：L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜盐和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜盐，再使用手性试剂进行拆分从而制得光学纯的L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。化学法主要存在理论收率、工艺条件复杂苛刻、环境污染大等缺点。生物法合成一般使用L-苏氨酸醛缩酶催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。

L-苏氨酸醛缩酶是一种PLP依赖型的酶，利用该酶能够一步合成高光学纯度的L-syn-对甲砜基本丝氨酸(图1)。相对于步骤繁多的化学合成法，该方法具有生产工艺简单，反应条件温和，产品光学纯度高，原子利用率高和生产过程污染较小等优点。使用L-苏氨酸醛缩酶制备L-syn-对甲砜基本丝氨酸过程中需要添加50-100μM的PLP做为辅酶。PLP是一种多功能辅酶，参与包括消旋、转氨、脱羧、醛缩等多种反应。然而辅酶PLP价格昂贵，增加了L-syn-对甲砜基本丝氨酸的生产成本。同时，添加的PLP在产品提纯过程中不易被分离，降低产品纯度。在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸生物合成工艺中如何能够减少甚至不加入PLP的情况下能够保证L-苏氨酸醛缩酶的正常催化、提高生产效率、降低生成成本是一个重要的研究方向。通过代谢调节促进大肠杆菌包内PLP浓度的相关研究已经成为当下热点，但是目前在L-苏氨酸醛缩酶的应用中没有相关报道。因此构建能够高效共表达PLP和L-苏氨酸醛缩酶的工程菌意义重大。

目前已知的PLP代谢途径3种：5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径，非5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径和补救途径。PLP的5-磷酸脱氧核酮糖依赖合成途径比较复杂，需要PdxF,PdxB,GapA/B,Dxs,PdxA,PdxJ,and PdxH等7中酶参与反应。PLP的补救途径比较简单，吡哆醛，吡哆醇，吡哆胺等前体经过一到两反应可以得到。但是这些前体价格昂贵。非5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径获得广泛关注，该途径只需要一种PLP合酶就能够将核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺合成PLP。因此，如果将该PLP合成途径引入大肠杆菌有望提高细胞体内的PLP浓度，以满足共表达苏氨酸醛缩酶对PLP的需求。实现在不添加外源PLP的情况下完成反应。

尽管L-苏氨酸醛缩酶有较高的选择性，应用前景广阔，但是游离的酶稳定性差，不能重复利用，而且难与产物分离，限制了其在工业化中的应用。固定化酶技术在生物催化过程中应用比较广泛。固定化酶能够提高酶的稳定性，提高催化效率，提高酶的利用率，降低生产成本。然而在利用L-苏氨酸醛缩酶生产L-syn-对甲砜基本丝氨酸的研究中，较少有固定化酶工艺的报道。同样，通过对PLP固定化的方式提高PLP的利用效率有助于降低PLP的用量，但是目前在L-苏氨酸醛缩酶的应用中没有相关报道。特别是共固定化L-苏氨酸醛缩酶和PLP的研究几乎处于空白。研究共固定化L-苏氨酸醛缩酶和PLP的工作意义重大，够有效推动L-苏氨酸醛缩酶在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸方面的工业应用。

发明内容