[发明专利]一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法

权利要求书

1.一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）根据枇杷18S RNA的ITS序列，设计了特异寡核苷酸引物和TaqMan探针；

2）利用改进的CTAB法提取枇杷蜜中植物源（枇杷花粉）的DNA成分；

3）利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA成分，设计荧光定量PCR方法，进行扩增，记录Ct值数据；

4）基于步骤3的Ct值数据汇合步骤2的DNA提取结果对检测样品进行判定。

2.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中ITS序列为枇杷Eriobotrya japonica的18S RNA，全长681bp,Genbank注册号为KJ170761~KJ170775。

3.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中寡核苷酸引物，上游序列为5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’；下游序列为5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’，扩增长度为212 bp；扩增序列位于枇杷18SRNA中第96至307bp范围。

4.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤1中TaqMan探针序列为FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA，其中FAM为报告荧光基团，TAMRA为淬灭荧光基团；TaqMan探针序列位于寡核苷酸上游引物下游40bp处，及寡核苷酸下游引物的上游101bp处。

5.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤2中枇杷蜜中的DNA提取采用改进后的CTAB法，20 mL蜂蜜样品中提取DNA浓度为10~500 ng/μL。

6.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤3中设计的荧光定量方法中反应体系为20μL，其中Premix ExTaq (2×)为10 μL；PCR上游和下游引物(10 μM)均为0.4 μL；TaqMan探针为0.8 μL；DNA模板为2 μL（20~50 ng），灭菌水为6.4 μL。

7.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤3中设计的荧光定量方法中第一步95℃ 20秒，1个循环；第二步95℃ 1秒，60℃ 20秒，40个循环数，激发波长为494nm，记录波长为522nm。

8.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于，步骤4中当循环阈值Ct值界于26.9~31.2时被认为枇杷蜜中具有合理的枇杷植物源成分。

9.根据权利要求1所述的一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，其特征在于所述步骤4中，以20 mL蜂蜜提取的50ng DNA为模板，若Ct值 34，则判定为浓缩掺杂蜜，此时提取的DNA浓度越高，混掺杂蜜越多，反之掺入浓缩或假蜜越多；若提取DNA浓度10 ng/μL，或DNA浓度极低或Ct 值34，均被判定为浓缩或掺假蜜。