[发明专利]一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法

说明书

本发明公开了一种基于植物花粉DNA提取和荧光定量的天然枇杷蜜检测和判定方法，属于生物技术领域。方法包括，步骤1：根据枇杷18S RNA的ITS序列，设计并获得了特异寡核苷酸引物和TaqMan探针；步骤2：利用改进的CTAB法提取了枇杷蜜中植物源（枇杷花粉）的DNA；步骤3：利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA，设计荧光定量PCR方法，进行扩增；步骤4：基于步骤3的结果对检测样品进行判定。使用本发明的植物花粉DNA提取和实时荧光定量PCR检测方法，能够特异、灵敏、准确地判定枇杷蜜样品中是否含有枇杷植物源成分，对枇杷蜜的掺杂、掺假鉴别起到一定作用。

技术领域

本发明涉及到天然蜂蜜的植物源DNA提取和检测实验，具体涉及到枇杷蜜中枇杷花粉植物源DNA的提取，荧光定量探针引物的设计、实验和判定方法。

背景技术

枇杷蜜是由蜜蜂采集枇杷Eriobotrya japonica花蜜酿制而成，枇杷树的开花期于每年的10月至12月，此时温度较低，一般只有耐低温的中华蜜蜂Apis cerana cerana采集，由于枇杷花期特殊，产量较低，枇杷蜜又具有清肺、泄热、化痰、止咳平喘等保健功效，因此枇杷蜜在蜂蜜市场属于蜜中上品，经济价值较高。部分不法商贩以杂次蜜、浓缩加工蜜甚至假蜜进行掺伪，导致枇杷蜜市场混乱，市场上难以觅寻真正的枇杷蜜。目前蜂蜜的真伪检测一般以蜂蜜酿制过程中次生代谢产物的小分子化学物质为检测对象，通过大型仪器如核磁共振、高效液相色谱串联质谱等进行检测，方法复杂、成本较高，难以满足市场需求。

由于蜜蜂在采集枇杷蜜的过程中会自然混入枇杷植物成分，即枇杷花粉及其DNA，真正的天然成熟枇杷蜜一定会含有适量的枇杷DNA。而目前市场有如下非天然成熟枇杷蜜来源，即①混入杂蜜如廉价的油菜蜜等掺杂蜜，其仍然含有大量的植物DNA，但非枇杷成分；②而经过高温浓缩处理后的浓缩加工蜜，由于高温破坏而几乎不含植物花粉或极少量的花粉DNA；③另外还有以果葡糖浆或大米糖浆等进行掺混的假蜜，由于并非蜂蜜，亦不会含有任何DNA成分。因此，通过对枇杷蜜中是否含有一定量的枇杷花粉DNA，即通过提取蜂蜜DNA的含量大小来判断是否是浓缩加工或掺假蜜；结合枇杷特异DNA荧光定量PCR结果，来判断是否是真正的枇杷蜜。本发明通过对枇杷植物源DNA的准确判定，对市场天然枇杷蜜的真伪情况提供一种可靠的判定方法。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明的目的在于提供一种准确判断枇杷蜜中是否含有枇杷花粉及其DNA含量的检测方法，可实现对市售枇杷蜜是否天然无掺假掺杂情况的准确判断。

所述的一种用于枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）根据枇杷18S RNA的ITS序列，进行寡核苷酸引物和TaqMan探针的设计

2）利用CTAB法提取枇杷蜜中植物源的DNA成分；

3）利用步骤1的寡核苷酸引物和TaqMan探针，以及步骤2中的提取的DNA成分，设计荧光定量PCR方法，进行扩增，记录Ct值数据；

4）基于步骤3的Ct值数据结果对检测样品进行判定。

所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤1中ITS序列为枇杷Eriobotrya japonica的18S RNA，全长681 bp,Genbank注册号为KJ170761~KJ170775。

所述的一种枇杷蜜植物源成分的荧光定量检测方法，其特征在于所述步骤1中寡核苷酸引物，上游序列为5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’；下游序列为5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’，扩增长度为212 bp；扩增序列位于枇杷18S RNA中第96至307bp范围。