[发明专利]基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法

说明书

本发明提供了基于DNA walker和G‑四链体‑血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法，属于基因工程技术领域，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2，核苷酸依次如SEQ ID No.1～5所示。采用本发明提供的序列组合和方法实现了待测物中低浓度EB病毒DNA的检测，提高了检测的灵敏度。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法。

背景技术

循环肿瘤DNA(ctDNA)，是循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性核酸，是由于肿瘤细胞增生活跃时的自动释放、肿瘤细胞凋亡、坏死等原因进入血液，并可用于肿瘤的无创诊断。ctDNA在血液中浓度低且存在高水平的正常循环DNA的干扰，因此建立特异性高、快速、高灵敏 ctDNA检测方法是一个很有挑战性的工作。为此，开发了具有信号扩增能力的各种策略，包括滚环扩增、链置换扩增、环介导等温扩增、荧光定量 PCR等。这些方法多为单重信号放大技术，难以实现超高灵敏循环核酸的检测，难以对肿瘤早期进行有效预测，同时这些方法扩增目标核酸需要蛋白酶(如DNA聚合酶)的参与，然而蛋白质酶易受实验条件(温度、pH和离子浓度)的影响，容易导致检测重现性和准确性差，另外还存在检测成本高、实验过程繁琐、需要昂贵的仪器设备等缺陷，而且标记荧光团的不完全猝灭可能导致背景很高，降低检测方法的灵敏度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合和方法，采用本发明提供的序列组合和方法，提高了检测EB病毒的灵敏度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了基于DNA walker和G-四链体-血红素DNA酶检测EB病毒的序列组合，包括DNA步行者探针、轨道分子、保护序列、序列1和序列2；

所述DNA步行者探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述轨道分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述保护序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了一种非诊断目的地基于上述技术方案所述的序列组合检测EB病毒的方法，包括以下步骤：

1)将所述DNA步行者探针和保护序列在95℃下处理5min、冷却，得到互补序列；

2)将所述轨道分子在95℃下处理5min、冷却，得到发夹结构；

3)将所述步骤1)得到的互补序列和步骤2)得到的发夹结构固定在微球上、封闭，得到固定有互补序列和发夹结构的微球；

4)将所述序列1固定在微球上、封闭，得到固定有序列1的微球；将所述序列2固定在微球上、封闭，得到固定有序列2的微球；

5)将所述步骤3)得到的固定有互补序列和发夹结构的微球与待测样品进行反应，得到反应物，将所述反应物离心，得到上清液；

6)将所述步骤4)得到的固定有序列1的微球与步骤5)得到的上清液杂交，得到杂交物；将所述步骤4)得到的固定有序列2的微球与 Cutsmart Buffer混合，得到混合物；将所述杂交物和混合物混合后进行孵育、离心，得到上清液；