[发明专利]一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用

说明书

本发明公开了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。本发明提供了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液，所述预混液包括T5核酸外切酶和反应缓冲液；所述反应缓冲液由乙酸钾、Tris‑乙酸、乙酸镁、DTT和甘油组成。该预混液试剂成分少且相应成本低，反应条件不依赖于恒温设备、冰水混合物中即可进行，反应时间较短、只需5～10min；因此，本发明预混液在构建重组质粒或点突变质粒、制备构建重组质粒或点突变质粒的试剂盒中应用前景良好。

技术领域

本发明属于分子克隆生物工程技术领域。更具体地，涉及一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。

背景技术

重组质粒构建是分子生物学实验中最基础、最重要的技术之一，依赖于限制性内切酶和T4 DNA连接酶的质粒构建方法仍然是最常用的手段之一。但随着生物技术的不断发展，重组质粒、载体的构建和修饰对克隆方法的要求也越来越高，传统的酶切和酶连方法的低效、步骤繁琐、序列限制使得它已经在很多方面受限。因此，GATEWAY技术和Gibson组装技术等多种基因克隆的新技术应运而生，克服了传统的酶切和酶连方法的限制；其中，GATEWAY技术的原理是利用λ噬菌体的位点特异重组系统，实验过程包括BP反应和LR反应，BP反应将目的基因克隆到一个donor载体上，然后LR反应将目的基因克隆到目标载体中，整个过程较为繁琐；Gibson组装技术是在体外利用三种不同类型的酶(T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶、Taq DNA连接酶)将目的DNA插入到线性载体中，形成完整的DNA分子。

目前，在依赖T5核酸外切酶的构建体系中，公开号为CN108841901A、公开日为2018年11月20日的中国发明专利公开了一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的试剂盒及其应用，由T5核酸外切酶和含PEG8000的缓冲体系组成，利用该试剂盒提高了DNA的组装效果，可以同时完成多个DNA片段的组装；但是，其反应温度为15℃～60℃、需要依赖于恒温设备，反应时间为10～60min、耗时长，实验流程及操作步骤较为繁琐，阳性率及获得的阳性克隆相对较低，且试剂PEG8000的成本很高。因此，提供一种成本低、不需要依赖恒温设备、反应时间短、阳性比率显著提高的方法具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。

本发明的目的是提供一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液。

本发明另一目的是提供所述预混液在构建重组质粒或制备构建重组质粒的试剂盒中的应用。

本发明另一目的是提供所述预混液在构建点突变质粒或制备构建点突变质粒的试剂盒中的应用。

本发明另一目的是提供一种构建重组质粒的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液，所述预混液包括T5核酸外切酶和反应缓冲液；所述反应缓冲液由乙酸钾、Tris-乙酸、乙酸镁、DTT和甘油组成。

优选地，所述乙酸钾的浓度为75～120mM。

更优选地，所述乙酸钾的浓度为100mM。

优选地，所述Tris-乙酸的浓度为30～50mM。

更优选地，所述Tris-乙酸的浓度为40mM。

优选地，所述乙酸镁的浓度为15～30mM。

更优选地，所述乙酸镁的浓度为20mM。

优选地，所述DTT的浓度为1～3mM。

更优选地，所述DTT的浓度为2mM。

优选地，所述甘油的体积分数为10％～15％。