[发明专利]一种免疫CIK细胞的诱导培养方法

权利要求书

1.一种免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)提取单个核细胞：

步骤2)CIK细胞培养：

步骤2.1)使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到3.0×10⁶～5.0×10⁶个/ml，接种至培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中维持培养2～3小时；

步骤2.2)向培养瓶补加培养基，培养基中含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μ mol/mL的诱导增殖肽，置于二氧化碳培养箱中维持培养24小时；

步骤2.3)将步骤2.2)中的细胞取样计数，用培养基重悬，按照1×10⁶-2×10⁶/ml的密度接种在培养瓶中，并加入1000U/mL的IFN-λ，置于二氧化碳培养箱中维持培养24小时；

步骤2.4)向培养瓶补加培养基以及1000IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15，培养基中含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽，置于二氧化碳培养箱中维持培养2天；

步骤2.5)每隔2-3天按体积比1∶1补加含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽的培养基，补加1000IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15，置于二氧化碳培养箱中维持培养；14～16天后收获细胞，即得CIK细胞。

2.如权利要求1所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，所述诱导增殖肽包括胞壁酰二肽。

3.如权利要求1所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤2.4)中补加培养基150ml～200ml；1000IU/ml的IL-2为70ul～80ul、20ng/ml IL-15为70ul～80ul。

4.如权利要求1所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤2.1)中的培养基含有1000U/mL的γ干扰素。

5.如权利要求4所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，所述二氧化碳培养箱培养条件为：5％的二氧化碳浓度，95％的湿度，37℃。

6.如权利要求1所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤2.2)中补加培养基为25～30ml。

7.如权利要求1所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤1)提取细胞采用如下操作：

步骤1.1)采集外周血：采集患者25～35ml外周血，转移到离心管中，在离心管中加入生理盐水，将外周血与生理盐水混合均匀；

步骤1.2)离心分离：将步骤1.1)中混合均匀的外周血与生理盐水转移加入至5～20m1人淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心分离，得分层的细胞液；

步骤1.3)提取单个核细胞：将步骤1.2)分层的细胞液，吸去上层血浆后，将红细胞层之上的液体转移至离心管中，加入生理盐水，混匀；

步骤1.4)清洗：将步骤1.3)得到的单个核细胞，以1300r/min-1400r/min的转速，4min-6min时间离心后，弃上清液，得外周血单个核细胞。

8.如权利要求7所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，步骤1.2)离心分离中，转速1800r/min-2200r/min，时间13min-18min。

9.如权利要求8所述的免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，所述步骤1.4重复2～3次。