[发明专利]一种免疫CIK细胞的诱导培养方法

说明书

本发明提供了一种免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)提取单个核细胞：步骤2)CIK细胞培养：步骤2.1)使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到3.0×10⁶～5.0×10⁶个/ml，接种至培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中维持培养2～3小时；步骤2.2)向培养瓶补加培养基，培养基中含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素‑1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽，置于二氧化碳培养箱中维持培养24小时。本发明的免疫CIK细胞的诱导培养方法培养CIK细胞增殖数量的稳定性好，增殖数量大。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种免疫CIK细胞的诱导培养方法。

背景技术

CIK最初是指在正常人体外周血中只占1～5％的CD3+CD56+的T淋巴细胞。CD3+CD56+ T细胞为自然杀伤活性T细胞(NKT细胞)，在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3+CD8+ T细胞为细胞毒性T细胞(CTL细胞)，是体内执行细胞免疫功能的主要效应细胞。CIK细胞可在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下直接杀伤肿瘤细胞，并且具有调节和增强机体免疫的功能，尤其是对手术和放化疗后的患者效果更为显著，能消除患者机体微小的残留或转移性病灶，防止癌细胞的扩散和复发，对改善患者生活质量以及提高患者生存率具有重要意义，是现今肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

CIK细胞尚不能直接从组织中大量分离获得，必须经过培养扩增。目前，CIK细胞的分离和培养技术主要存在以下缺点：CIK细胞纯度和活性低，混杂有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、血小板等，当细胞碎片回输入人体后易引发病人出现发热、炎症等不良反应。CIK细胞增殖速度慢，数量少。CIK细胞有效抑瘤因子表达水平低。CIK细胞的细胞毒性与CD3+CD56+的表达水平呈正相关，现有技术培养的CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞比例低，双阳性表达率不足。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种免疫CIK细胞的诱导培养方法，该培养方法使CIK细胞增值快，CD3+CD56+双阳性细胞比例高。

为实现上述目的，本发明实施例所采用的技术方案如下：

一种免疫CIK细胞的诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)提取单个核细胞：

步骤2)CIK细胞培养：

步骤2.1)使用培养基，将外周血单个核细胞的密度调整到3.0×106～5.0×106个/ml，接种至培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中维持培养2～3小时；

步骤2.2)向培养瓶补加培养基，培养基中含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽，置于二氧化碳培养箱中维持培养24小时；

步骤2.3)将步骤2.2)中的细胞取样计数，用培养基重悬，按照1×106-2×106/ml的密度接种在培养瓶中，并加入1000U/mL的IFN-λ，置于二氧化碳培养箱中维持培养24小时；

步骤2.4)向培养瓶补加培养基以及1000IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15，培养基中含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽，置于二氧化碳培养箱中维持培养2天；

步骤2.5)每隔2-3天按体积比1∶1补加含有2000U/mL的血清、0.3mg/ml的白细胞介素-1、1000U/mL的γ干扰素和15μmol/mL的诱导增殖肽的培养基，并补加1000IU/ml IL-2、20ng/ml IL-15，并置于二氧化碳培养箱中维持培养；14～16天后收获细胞，即得CIK细胞。