[发明专利]KIT基因修饰的非人动物的制备方法和应用有效
| 申请号： | 202010925873.9 | 申请日： | 2020-09-04 |
| 公开（公告）号： | CN112553194B | 公开（公告）日： | 2023-04-07 |
| 发明（设计）人： | 沈月雷;张美玲;黄蕤;郭雅南;白阳;姚佳维;郭朝设 | 申请（专利权）人： | 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10;C07K14/705;C07K14/82;A01K67/027;A61K49/00 |
| 代理公司： | 北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11690 | 代理人： | 徐丹丹;刘玉玲 |
| 地址： | 102609 北京市大兴区中关*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | kit 基因 修饰 非人 动物 制备 方法 应用 | ||
1.一种KIT基因修饰的非人动物的制备方法，其特征在于，所述的非人动物表达突变的KIT蛋白，所述突变的KIT蛋白如SEQ ID NO：4所示，编码所述突变的KIT蛋白的KIT基因序列为SEQ ID NO：1第2040位由C突变为T、1945位由C突变为T、1963位由G突变为A、2023位由C突变为T和2044位由G突变为T；
所述的构建方法包括使用靶向载体，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：4所示第626-662位氨基酸序列的核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和3’臂，所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段；
所述的待改变的转换区位于KIT基因的13号外显子；
所述的非人动物为NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述突变的KIT蛋白的KIT基因包含SEQ ID NO：3。
3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，所述KIT基因修饰的非人动物为使用sgRNA和靶向载体将非人动物KIT基因座的第13外显子引入一个或多个点突变制备获得；所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：5-8任一项所示，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：4第626-662位氨基酸的核苷酸序列。
4.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO：4第626-662位氨基酸的核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂和3’臂，所述的5’臂如SEQ ID NO：14所示；所述的3’臂如SEQ ID NO：15所示。
5.一种靶向KIT基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ IDNO：5-8任一项所示。
6.一种制备多基因修饰的非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用权利要求1-3任一所述的制备方法构建的KIT基因修饰的非人动物；
（2）将步骤（1）制备获得的KIT基因修饰的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
7.一种编码突变的KIT蛋白的KIT基因，其特征在于，所述的KIT基因序列为SEQ ID NO：1第2040位由C突变为T、1945位由C突变为T、1963位由G突变为A、2023位由C突变为T和2044位由G突变为T。
8.根据权利要求7所述的KIT基因，其特征在于，所述的KIT基因序列包含SEQ ID NO：3。
9.一种细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织表达突变的KIT蛋白，所述突变的KIT蛋白如SEQ ID NO：4所示；编码所述突变的KIT蛋白的KIT基因序列为SEQ ID NO：1第2040位由C突变为T、1945位由C突变为T、1963位由G突变为A、2023位由C突变为T和2044位由G突变为T。
10.根据权利要求9所述的细胞、组织、器官或荷瘤后的瘤组织，其特征在于，编码所述突变的KIT蛋白的KIT基因包含SEQ ID NO：3。
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