[发明专利]KIT基因修饰的非人动物的制备方法和应用

说明书

本发明涉及基因修饰的非人动物，特别是基因修饰的啮齿动物，尤其是基因修饰的小鼠，具体涉及一种表达突变的KIT蛋白的KIT基因修饰的非人动物。本发明还提供了一种上述非人动物的制备方法及其在生物医药领域的应用。

技术领域

本申请涉及基因修饰的动物、制备方法及应用，具体而言，涉及基于一种表达突变的KIT蛋白的基因修饰的动物、制备方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-Prkdc^scidIL-2rγ^nul小鼠〉NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/- (NRG)〉Rag 2^-/--IL2rg^-/- (RG)〉NOD/SCID〉裸鼠，表明NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^nul小鼠是目前最佳的移植受体鼠（Ito R et al. Cell MolImmunol. 2012 May;9(3):208-14）。

然而NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠仍然存在缺陷，尽管由于该小鼠机体免疫功能严重降低，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤（依赖于细胞系或细胞类型），同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化动物模型研发。但在免疫系统重建前需要进行辐照清髓，该程序需要有放射源且会对小鼠产生多种副作用，包括造血系统、胃肠道、肌肉和神经组织的坏死和凋亡，可导致小鼠消瘦、感染甚至死亡，进而影响药效评价结果。如果小鼠宿主造血干细胞缺失，则可以免于辐照清髓，将会提高药效评价效果同时降低建模时间和成本。

人KIT基因（又称c-KIT）是一种原癌基因，起源于HZ4猫肉瘤病毒，位于人染色体4q12，在4号染色体长臂中心体周围区域，是白色斑点显性基因的等位基因。人KIT基因组DNA全长大约89kb，包括21个外显子。KIT基因编码的蛋白质被称为KIT或c-KIT受体，是一个分子量为145KD的I型跨膜糖蛋白，属于III型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员。分布于细胞膜表面，由胞外结构域、单一跨膜区及胞内酪氨酸激酶区域组成。胞外区含5个免疫球蛋白样的结构域，前三个免疫球蛋白为其配体干细胞生长因子（SCF）的结合位点，后两个在稳定及诱导KIT受体的二聚化方面起重要作用。

KIT与配体SCF共同参与多种细胞信号的传导，如Jak/STAT信号途径、PL3K途径、Ras/Raf/MEK/ERK信号途径等，从而在黑素生成、配子发生和造血系统细胞的存活、增殖和分化过程发挥重要作用。KIT/SCF信号传导途径受KIT调节，KIT基因突变在多种生物中会引起各种不同的表型特征，包括白化、贫血、纯合子死亡、听力受损等，这些表型可归结为发育时相应干细胞群的增殖或迁移缺失，且不同KIT突变体对细胞分化影响程度不同。在小鼠中，当KIT突变纯合时，往往对小鼠产生致死或半致死作用。有研究显示KIT突变会影响宿主造血干细胞的发育，产生不同程度的贫血，因此对于血液系统来说KIT是正常造血所必须的。

由于免疫缺陷模式动物是肿瘤临床治疗研究重要的工具和保障，本发明旨在克服现有技术中的不足，提供一种小鼠细胞中与造血干细胞相关的KIT基因突变的小鼠。该小鼠遗传背景单一，实验结果稳定可靠，不用辐照清髓即可进行人造血干细胞免疫系统重建，且移植后成功率高、寿命长等优点。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型研发与药效检测应用等方面。

发明内容