[发明专利]一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用

说明书

本发明公开一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了用于罗氏沼虾遗传多样性分析的SSR分子标记引物组，包括8对引物；本发明还提供了所述SSR分子标记引物组的获取方法；本发明还提供了所述SSR分子标记引物组在罗氏沼虾遗传多样性分析中的应用，所述引物组能有效对罗氏沼虾种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析。本发明所述的8对引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，丰富了罗氏沼虾种质资源遗传多样性分析的方法。

技术领域

本发明涉及SSR引物组领域，特别是涉及一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用。

背景技术

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii),又称大头虾、马来西亚大虾,隶属于节肢动物门,软甲纲,十足目,长臂虾科,沼虾属,原产于东南亚,是目前世界上重要的淡水养殖虾类之一,也是世界上最大的淡水虾。它在水生态系统中分布较广,在淡水区域(如江河、湖泊)和半咸水区域(如河口)均有分布,对水环境中的理化指标变化反应较敏感。它具有生长速度快、食性较广、生长周期短和抗病能力强等特点,自1976年该虾引入我国以来,已在浙江、江苏、上海、广东、广西、湖南、湖北等十多个省市自治区养殖推广。

SSR(simple sequence repeat,简单重复序列),由2-6个核苷酸为重复单元组成的DNA序列,同一类SSR可分布于基因组的不同位置上，由于其重复次数和重复程度不同而形成每个座位的多态性，在真核生物的基因组中分布广泛。这一序列具有共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖高等优点。因此，开发共显性的SSR分子标记引物用于罗氏沼虾的遗传多样性及品种鉴定保护等相关研究是十分必要的。目前，对于罗氏沼虾的SSR引物开发及相关遗传研究报道相对较少，极大的限制了罗氏沼虾的遗传多样性分析等相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组，所述引物组由8对SSR引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～16所示。

进一步的，所述引物组通过以下步骤得到：

(1)获取罗氏沼虾转录组序列，具体为：随机选择的罗氏沼虾3个健康个体的卵巢组织，提取RNA并等量混和；纯化并回收RNA；构建文库并测序；

(2)使用MISA v1.0对步骤(1)获得的序列进行SSR位点的筛选；

(3)罗氏沼虾转录组的设计：依据步骤(2)筛选的SSR位点，进行SSR引物设计，得到罗氏沼虾SSR标记引物组。

进一步的，先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后再进行SSR位点的筛选；筛选标准包括以双核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于6次；以三核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以四核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于5次；以五核苷酸为重复单位时，其重复数至少为4；以六核苷酸为重复单位时，其重复数大于或等于4次。

本发明还提供了所述引物组合物在鉴评罗氏沼虾遗传多样性中的应用。

进一步的，利用罗氏沼虾转录组鉴评罗氏沼虾遗传多样性的方法，包括如下步骤：

(1)取待分析罗氏沼虾的DNA；

(2)将SEQ NO.1～16所示引物组的5’端标记FAM；

(3)以步骤(1)待测样品DNA为模板，利用步骤(2)所述5’端标记FAM后的SEQ NO.1～16所示引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行毛细管电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目，得到统计结果；