[发明专利]一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法

权利要求书

1.一种构建重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK基因的活性、降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK基因的含量或/和降低或抑制所述目的伪狂犬病毒中TK基因的表达量，并在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，得到重组伪狂犬病毒；所述TK基因为氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的蛋白质；所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒Bartha-K61株；

所述降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK基因的活性、降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK基因的含量或/和降低或抑制目的伪狂犬病毒中TK基因的表达量，是通过敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因实现的；在所述目的伪狂犬病毒中表达目的外源基因，是通过在所述目的伪狂犬病毒中插入所述目的外源基因实现的；所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因是利用CRISPR/Cas9系统实现，所述插入所述目的外源基因是通过导入目的外源基因插入DNA片段1实现，所述目的外源基因插入DNA片段1是由所述TK基因的上游同源臂、所述目的外源基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子；

所述方法为方法A或方法B：

所述方法A中所述目的外源基因为标记基因，所述方法A包括如下X1-X3的步骤：

X1、构建用于敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因的包含双sgRNA和Cas9的重组质粒；所述双sgRNA是以所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因为拟敲除基因，所述双sgRNA为gRNA1和gRNA2；所述双sgRNA以核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的两个片段作为靶序列；

X2、构建含有所述TK基因同源臂和所述标记基因的供体质粒，所述供体质粒含有所述目的外源基因插入DNA片段1；

X3、将X1构建的质粒和X2构建的质粒共转染细胞后，接种所述目的伪狂犬病毒后，利用标记进行筛选，得到所述TK基因插入突变并表达所述目的外源基因的重组伪狂犬毒株，该重组伪狂犬毒株即为所述重组伪狂犬病毒；

所述方法B中，所述目的外源基因为非标记基因，所述方法B包括如下X1-X6的步骤:

X1、构建用于敲除所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因的包含双sgRNA和Cas9的重组质粒；所述双sgRNA是以所述目的伪狂犬病毒中所述TK基因为拟敲除基因，所述双sgRNA为gRNA1和gRNA2；所述双sgRNA以核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的两个片段作为靶序列；

X2、构建含有所述TK基因同源臂和标记基因的供体质粒，所述供体质粒含有插入DNA片段1-1，所述插入DNA片段1-1是由所述TK基因的上游同源臂、标记基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子；

X3、将X1构建的质粒和X2构建的质粒共转染细胞后，接种所述目的伪狂犬病毒后，利用标记进行筛选，得到TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株；

X4、构建用于敲除所述TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株中所述TK基因的双sgRNA和Cas9重组质粒；所述双sgRNA是以所述TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株中的所述标记基因为拟敲除基因；所述双sgRNA为gRNA3和gRNA4；所述双sgRNA以核苷酸序列分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.10所示的两个片段作为靶序列；

X5、构建含有所述TK基因同源臂和所述目的外源基因的供体质粒；所述供体质粒含有名称为所述目的外源基因插入DNA片段1-2，所述目的外源基因插入DNA片段1-2是由所述TK基因的上游同源臂、所述目的外源基因的表达盒和所述TK基因的下游同源臂连接而成的双链DNA分子；

X6、将X4构建的质粒和X5构建的质粒共转染细胞后，接种所述TK基因插入突变并表达所述标记基因的重组伪狂犬毒株后，利用标记进行反向筛选，得到TK基因插入突变并表达目的外源基因的重组伪狂犬毒株，该重组伪狂犬毒株即为所述重组伪狂犬病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标记基因为EGFP的编码基因；所述EGFP为如下B1）或B2）的蛋白质：

B1）其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

B2）与B1）具有98%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。